蛋白純化系統(tǒng)化常見問題總結(jié)
使用Blupadstart蛋白純化系統(tǒng)過程中常遇見一些問題，這里整理了以下幾個蛋白純化實驗中遇見的問題及其解決方案。
1)我現(xiàn)在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。
既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點，這也是個辦法。
2)請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過20來種，你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián)，何況它們幾乎是同一個輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個仲胺，可以偶聯(lián)到帶長手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好，因此我覺得這個沒有什么問題。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍色瓊脂糖凝膠，因為它的配基的結(jié)構(gòu)和FMN的三個環(huán)很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應的偶聯(lián)的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基*好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻報導固定輔酶時，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要先對自己的配基有一個清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我一般在合成的時候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應基團。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺得是不錯的選擇。
包涵體的蛋白復性做得不多，但是我記得有個哥們說*管用的辦法也是*簡單的方法，他說在復性的時候盡量別想什么太高難的技術，那些時髦但不一定好用，常用的有透析復性，稀釋復性，包括國外的專家也這么說。我覺得有時候開始摸不出來未必就是方法不行，關鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復性很時髦，但是真正能用的不是很多，我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關鍵要多看文獻，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時，鹽濃度太高對柱效有影響嗎?若有，一般對鹽濃度限度如何?
大家別客氣，除鹽對于濃度應該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要高點，但是在正常的范圍如1-2M應該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達到100%，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?(當然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應該是不錯的選擇。此外PEG是個疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強，修飾度越高，疏水性越強，可以用這個原理分離。離子交換也可以選擇，因為同樣道理，修飾度越高，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此應該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個方法里選擇看哪個更經(jīng)濟好用就可以。
5)我有個問題困繞很久，從**中提取酶，好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點甘油或者PEG來提取?
其實這個問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標蛋白的分子量你是應該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取一個酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設計個方案，這樣才能解決問題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討。
6)HPLC是用來分析檢測或分離純化?
如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來分析檢測，怎樣指導以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時配合質(zhì)譜等就可以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好，定量準確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。
分析出來后如果這個物質(zhì)很穩(wěn)定，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應有了制備的條件。
1)我現(xiàn)在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。
既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點，這也是個辦法。
2)請問有沒有合成過配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過20來種，你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián)，何況它們幾乎是同一個輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個仲胺，可以偶聯(lián)到帶長手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好，因此我覺得這個沒有什么問題。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍色瓊脂糖凝膠，因為它的配基的結(jié)構(gòu)和FMN的三個環(huán)很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應的偶聯(lián)的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基*好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻報導固定輔酶時，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要先對自己的配基有一個清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我一般在合成的時候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應基團。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺得是不錯的選擇。
包涵體的蛋白復性做得不多，但是我記得有個哥們說*管用的辦法也是*簡單的方法，他說在復性的時候盡量別想什么太高難的技術，那些時髦但不一定好用，常用的有透析復性，稀釋復性，包括國外的專家也這么說。我覺得有時候開始摸不出來未必就是方法不行，關鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復性很時髦，但是真正能用的不是很多，我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關鍵要多看文獻，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時，鹽濃度太高對柱效有影響嗎?若有，一般對鹽濃度限度如何?
大家別客氣，除鹽對于濃度應該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要高點，但是在正常的范圍如1-2M應該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達到100%，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開?(當然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應該是不錯的選擇。此外PEG是個疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強，修飾度越高，疏水性越強，可以用這個原理分離。離子交換也可以選擇，因為同樣道理，修飾度越高，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此應該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個方法里選擇看哪個更經(jīng)濟好用就可以。
5)我有個問題困繞很久，從**中提取酶，好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強，需要加助溶劑才能提取出來?另外，我是不是也可以加點甘油或者PEG來提取?
其實這個問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標蛋白的分子量你是應該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取一個酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設計個方案，這樣才能解決問題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續(xù)探討。
6)HPLC是用來分析檢測或分離純化?
如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來分析檢測，怎樣指導以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時配合質(zhì)譜等就可以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好，定量準確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。
分析出來后如果這個物質(zhì)很穩(wěn)定，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應有了制備的條件。
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