Ca2+作為普遍的第二信使在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著非常重要的作用，是單個細(xì)胞生存和死亡的信號。它參與了神經(jīng)傳導(dǎo)、血液凝固、肌肉收縮、心臟收縮、大腦功能、酶功能以及內(nèi)分泌腺的激素分泌等各種生理機能。而人們對Ca2+在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作用的認(rèn)識，則很大程度上取決于Ca2+測定技術(shù)。

目前常用的Ca2+檢測方法主要有：Ca2+選擇性微電極測定法、同位素示蹤法、核磁共振法和水母發(fā)光蛋白檢測法等。
 

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Ca2+選擇性微電極測定法:Ca2+選擇性微電極一種電化學(xué)敏感器。利用內(nèi)充液和組織或細(xì)胞之間產(chǎn)生電位差，理想情況下，該電位差是Ca2+對數(shù)的線性函數(shù)，遵循Nernst方程。

優(yōu)點：直接、敏感地測定組織或細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，不需使用指示劑，不影響結(jié)合鈣和游離鈣的平衡。

缺點：反應(yīng)速度慢而無法測定Ca2+的快速變化，而且穿刺損傷細(xì)胞可引起滲漏，且不適用于太小的細(xì)胞。

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同位素示蹤法：用放射性核素45Ca2+對Ca2+進(jìn)行示蹤，可測量出通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加的速度及濃度的大小，揭示Ca2+泵的作用，目前主要用于測定跨膜Ca2+的流動。
優(yōu)點：測量方法簡單易行，比普通化學(xué)分析法的靈敏度高。確定放射性示蹤劑在組織器官內(nèi)的定量分布，可以達(dá)到細(xì)胞、亞細(xì)胞乃至分子水平。
缺點：靜態(tài)效果差，需要特定的同位素測定儀，并且要注意示蹤劑的同位素效應(yīng)和放射效應(yīng)問題。
 

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核磁共振法：是一種新的、非光學(xué)技術(shù)的Ca2+檢測方法。由于正常生物體內(nèi)氟含量很少，為了得到足夠的響應(yīng)，在檢測時需要使用含氟指示劑。該指示劑經(jīng)過化學(xué)修飾后進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而被水解成游離狀態(tài)，然后與Ca2+結(jié)合，根據(jù)獲得的波譜圖計算出Ca2+的濃度。
優(yōu)點：具有非破壞性和無損傷性，能夠在接近生物樣本生理狀態(tài)下連續(xù)動態(tài)地進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確反應(yīng)Ca2+濃度。
缺點：需要核磁共振儀，成本較高。

 

熒光探針法：目前常用的Ca2+熒光探針有Fluo-3、Fluo-4、Fluo-８等。這類探針本身無法進(jìn)入細(xì)胞，但它的親脂性衍生物卻可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，這類親脂性衍生物的親脂性封閉基團在細(xì)胞非特異性酯酶的作用下被分裂除去，在細(xì)胞內(nèi)便會形成一種帶負(fù)電荷的熒光染料。與胞內(nèi)Ca2+結(jié)合時，其熒光強度顯著增加。
優(yōu)點：指示劑易導(dǎo)入細(xì)胞，空間分辨率高，反應(yīng)速度快，而且可同時檢測多重離子。
缺點：需要有熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡，成本較高。

 

 

水母發(fā)光蛋白檢測法:  最近十幾年來，水母發(fā)光蛋白(Aequorin)很受人們的關(guān)注。水母發(fā)光蛋白由189個氨基酸組成，具有3個Ca2+結(jié)合的EFhand結(jié)構(gòu)，所以水母發(fā)光蛋白可作為檢測Ca2+的新型探針。
優(yōu)點：Ca2+/水母蛋白復(fù)合物能檢測~0.1μm到＞100μm范圍內(nèi)的鈣離子濃度，且復(fù)合物不會從細(xì)胞內(nèi)泄露出來，可檢測幾小時至數(shù)十天內(nèi)Ca2+濃度的變化。比熒光探針法的背景低，樣本本身不會發(fā)生自熒光。

 

00000000腔腸素的性質(zhì)00000000

腔腸素(Coelenterazine)作為海洋動物體內(nèi)貯存光能的分子，它廣泛存在于海洋生物體內(nèi)，比如海腎、海蜇、水螅等。腔腸素是天然熒光素中最普遍的，它可作為很多熒光素酶的底物。目前研究得最透徹的以腔腸素為底物的熒光素酶來源于海腎（Renilla），即海腎熒光素酶（Renilla reniformis，簡稱Rluc）。

腔腸熒光素是一個分子量約400 Da 的疏水基團，它可以自由穿越細(xì)胞膜。在一個以熒光素/熒光素酶為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中，腔腸素作為以水母發(fā)光蛋白為代表的海洋發(fā)光蛋白的輔助因子，與水母發(fā)光蛋白進(jìn)行穩(wěn)定的結(jié)合，引起脫輔基水母發(fā)光蛋白和腔腸熒光素之間的共價鍵破裂，腔腸熒光素(Coelenterazine)被氧化脫羧，形成腔腸酰胺（Coelenteramide），釋放出CO2，同時發(fā)出波長為469nm的藍(lán)色生物熒光，該熒光可用博鷺騰高靈敏度管式/板式發(fā)光檢測儀進(jìn)行測定。
 

圖1.腔腸素/水母發(fā)光蛋白檢測Ca2+機制
 

  由于Ca2+在生命活動的各種生理生化反應(yīng)、疾病的發(fā)生和發(fā)展中都扮演著極其重要的角色，而游離的Ca2+濃度變化又與細(xì)胞的功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)乃至細(xì)胞的凋亡有密不可分的聯(lián)系，因此，研究如何檢測細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯得尤為重要。