本文作者利用飛秒脈沖激光法制備了新型的“超亮Ag2S量子點(diǎn)”，實(shí)現(xiàn)了超低劑量注射下的動(dòng)物活體再深層組織內(nèi)的高分辨成像。

 

量子點(diǎn)作為一種半導(dǎo)體納米粒子，其吸收和發(fā)射光譜隨尺寸變化而變化，因此量子點(diǎn)在照明、顯示器、激光器和生物熒光成像等領(lǐng)域都有著十分重要的作用。硫化銀（Ag2S）作為典型的二元半導(dǎo)體，其帶隙較窄（約1.1ev），在近紅外區(qū)域具有熒光發(fā)射的性質(zhì)，且由于其較低的毒性在近紅外二區(qū)成像方面具有較好的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)方法制備Ag2S量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率低于1%，這是由于傳統(tǒng)的Ag2S量子點(diǎn)表面與結(jié)構(gòu)缺陷以及量子點(diǎn)與溶劑相互作用引起的非輻射途徑增加，此外高溫條件是制備傳統(tǒng)Ag2S量子點(diǎn)所必需的，由于Ag離子具有較高的還原勢(shì)能，從而不可避免地形成Ag納米粒子，通過等離子體耦合使得Ag2S亮度降低，而較低的亮度會(huì)導(dǎo)致成像信噪比低，空間分辨率不高，為了解決這一問題，作者利用飛秒脈沖激光照射傳統(tǒng)方法制備的Ag2S量子點(diǎn)的氯仿溶液，在飛秒時(shí)間尺度上發(fā)生Ag+與CHCl3溶質(zhì)分子的超快光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的AgCl分子附著在Ag2S納米粒子表面形成一層保護(hù)殼，減少了量子點(diǎn)的非輻射途徑，使得新制備的Ag2S“超亮點(diǎn)”量子產(chǎn)率相較傳統(tǒng)Ag2S量子點(diǎn)提升了80倍，PEG化后的“超亮點(diǎn)”可以生物安全級(jí)別的低激發(fā)功率激發(fā)（10mW/cm-2）和低劑量給藥（＜0.5mg/Kg），從而在深層組織實(shí)現(xiàn)高分辨成像。

基于傳統(tǒng)方法合成的Ag2S量子點(diǎn)，經(jīng)過飛秒脈沖激光照射后，會(huì)發(fā)生肉眼可見的變化（圖1a），這種變化體現(xiàn)在吸收光譜上是位于400-500nm波段處傳統(tǒng)的Ag2S量子點(diǎn)有一個(gè)突出的肩峰（圖1b），此系A(chǔ)g納米粒的等離子共振吸收，而“超亮點(diǎn)“無此吸收，這是因?yàn)榻?jīng)過飛秒脈沖激光處理后”超亮點(diǎn)“內(nèi)的Ag納米粒轉(zhuǎn)化為AgCl保護(hù)殼。此外，作者還驗(yàn)證了飛秒脈沖激光的最優(yōu)照射時(shí)長(zhǎng)為50min（圖1d&e），此外熒光壽命隨著照射時(shí)間的變化與量子產(chǎn)率的變化趨勢(shì)一致（圖1f）。

 

圖1：a）Ag2S量子點(diǎn)飛秒脈沖激光處理前（左）與處理后（右）的對(duì)比圖；b）Ag2S量子點(diǎn)與Ag2S超亮點(diǎn)吸收光譜；c）飛秒脈沖激光（50fs，90min，9W cm-2）處理前（左）和處理后（右）在808nm連續(xù)波激光激發(fā)下的熒光成像對(duì)比圖；d）飛秒脈沖激光不同照射時(shí)間下，Ag2S 的CHCl3溶液對(duì)應(yīng)的NIR-II發(fā)射光譜。插圖顯示了808nm激光照射前后樣品歸一化后的發(fā)射光譜；e）飛秒脈沖激光不同照射時(shí)間下的量子產(chǎn)率（QY）的變化曲線；f）飛秒脈沖激光不同照射時(shí)間下的熒光壽命曲線。

 

為了探究此種現(xiàn)象的原因，作者分別研究了各種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響。作者從飛秒激光功率、溶劑、是否含Ag納米粒以及不同脈沖時(shí)間等因素探討了可能的機(jī)理。首先是脈沖激光（50fs）的功率要適中，過低的功率（3W/cm-2）無法引起光化學(xué)反應(yīng)，而過高的功率（100W/cm-2）又會(huì)導(dǎo)致樣品降解（圖2a）。其次，在正己烷、水、氯仿和甲苯中，只有氯仿能引起量子產(chǎn)率增加的現(xiàn)象（圖2b），如果Ag2S量子點(diǎn)不含有Ag納米粒，也不會(huì)產(chǎn)生此現(xiàn)象（圖2c），最后，脈沖間隔為50fs的條件下產(chǎn)生最優(yōu)的結(jié)果。而持續(xù)照射的激光不引起任何變化甚至導(dǎo)致熒光減弱（圖2d）�；�于以上種種結(jié)果，作者給出了對(duì)產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能的機(jī)理解釋，如下圖2e所示，當(dāng)用808nm的飛秒脈沖激光照射時(shí)，Ag納米粒子雙光子吸收后會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生高的自由電子密度，從而引起Ag粒子的庫(kù)侖爆炸，產(chǎn)生高反應(yīng)活性的Ag+，并與CHCl3反應(yīng)生成AgCl，附著在Ag2S上形成保護(hù)殼，低帶隙的Ag2S（0.9ev）表面覆蓋著的高帶隙（5.13ev）無機(jī)化合物AgCl保護(hù)層可大大減少氯仿溶質(zhì)分子振動(dòng)活化的非輻射躍遷，并防止淺或深中間能隙態(tài)形成的可促進(jìn)非輻射去激發(fā)途徑的表面陷阱，從而促進(jìn)熒光量子產(chǎn)率激增。

 

圖2：a）飛秒激光不同功率激發(fā)下的時(shí)間-熒光密度演化曲線（50fs）；b）不同溶劑條件下照射時(shí)間-熒光密度演化曲線；c）含有與不含Ag納米粒子的時(shí)間-熒光密度演化曲線；d）50fs、100fs、200fs、500fs以及持續(xù)照射條件下的時(shí)間-熒光密度曲線；e）可能的機(jī)理解釋示意圖

 

隨后作者進(jìn)行了動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)，作者首先在Ag2S表面修飾PEG鏈并和傳統(tǒng)的Ag2S對(duì)比了熒光壽命（圖3a），為了證明“超亮點(diǎn)“的優(yōu)異發(fā)光性能，作者選取了單壁碳納米管、稀土摻雜材料以及傳統(tǒng)的Ag2S量子點(diǎn)進(jìn)行了動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)，如圖3b所示，在任何激發(fā)功率條件下，”超亮點(diǎn)“的發(fā)光性能最優(yōu)，憑借于此，其信噪比是所有實(shí)驗(yàn)組中最高的（圖3c&d）。小鼠左后肢血管成像進(jìn)一步證實(shí)了該材料的優(yōu)異性能，如下圖3f，兩只小鼠左后肢分別注射傳統(tǒng)Ag2S（左側(cè)）和”超亮點(diǎn)“（右側(cè)）后立即成像，15s后可以看到血管亮度有明顯差異，通過扣除背景熒光獲得凈信號(hào)圖像（圖3g），同時(shí)除以背景信號(hào)值獲得信噪比對(duì)比圖（圖3h），兩者均顯示出”超亮點(diǎn)“在提升信噪比方面具有更好的效果，對(duì)大隱動(dòng)脈處的凈信號(hào)（圖3i）和信號(hào)-背景分布定量結(jié)果（圖3j）也顯示出相比于傳統(tǒng)Ag2S量子點(diǎn)，作者開發(fā)的新型Ag2S量子點(diǎn)將凈信號(hào)提升了60%，信噪比提升了90%。

 

圖3：a）PEG化傳統(tǒng)Ag2S量子點(diǎn)與“超亮點(diǎn)的近紅外熒光衰減曲線；b）不同近紅外熒光材料小鼠成像對(duì)比圖；c）激光功率-信噪比曲線；d&e）不同功率下小鼠成像對(duì)比圖和激光功率-信噪比曲線；f）兩只小鼠靜脈注射Ag2S點(diǎn)(左圖)和”超亮點(diǎn)“(右圖)前后15s的NIR-Ⅱ熒光圖像；g）凈信號(hào)圖像（由圖f中底部圖像扣除圖f中上方背景圖像得到）；h）信噪比對(duì)比圖(由圖f中底部圖像除以f中上方背景圖像得到)；i）& j）分別為在圖g和h中白色虛線所劃的大隱動(dòng)脈的凈信號(hào)與信噪比對(duì)比圖。

 

最后，作者對(duì)所開發(fā)的新型Ag2S量子點(diǎn)進(jìn)行了生物安全性實(shí)驗(yàn)。作者對(duì)小鼠尾靜脈注射了總量為0.5µg（~0.5mg/Kg）的Ag2S量子點(diǎn)，該劑量比傳統(tǒng)Ag2S量子點(diǎn)的用量（6.6mg/Kg）少了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這種成本節(jié)約型和低毒性的探針為未來的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用打開了新的大門。小鼠全身成像后發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)大多數(shù)聚集在肝臟之中（圖4a），此外脾臟和心臟也有少許攝取（圖4b&c）,此外在小鼠的進(jìn)食量、體重和體溫方面，進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無明顯變化（圖4d&e&f）。生化指標(biāo)方面，作者分別測(cè)量了谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清堿性磷酸酶(ALP)、肌酸酐和膽紅素的第1和28天的含量變化，結(jié)果顯示無明顯指標(biāo)改變，證明了作者所開發(fā)的新型Ag2S量子點(diǎn)在低劑量下的生物安全性。作者認(rèn)為這是一個(gè)很有希望的結(jié)果，需要指出的是，新型Ag2S“超亮點(diǎn)“的臨床轉(zhuǎn)化需要進(jìn)一步的毒性實(shí)驗(yàn)，包括研究最大耐受劑量、清除途徑以及對(duì)生理、代謝、行為和認(rèn)知的影響，這個(gè)過程將會(huì)是漫長(zhǎng)的，但該研究結(jié)果可能為未來的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)并為其他研究人員帶來新的研究思路。

 

圖4：a）注射“超亮點(diǎn)“后不同時(shí)間點(diǎn)的NIR-Ⅱ成像圖；b）肝臟、脾臟、心臟和股動(dòng)脈熒光強(qiáng)度-時(shí)間分布曲線；c）肝臟、脾臟、心臟與肺的NIR-Ⅱ與光學(xué)成像圖；d）、e）和f）分別為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠兩周內(nèi)進(jìn)食量、體重和體溫變化曲線；g）、h）、I）、j）和k）分別為實(shí)驗(yàn)組小鼠第1和28天的ALT、ALP、AST、肌酸酐和膽紅素的含量變化。

 

參考文獻(xiàn)

Santos H D A, Gutiérrez I Z, Shen Y, et al. Ultrafast photochemistry produces superbright short-wave infrared dots for low-dose in vivo imaging[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1-12.

 

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