目前在腫瘤免疫療法中，阻斷免疫檢查點(diǎn)是最有前景的療法之一。其中，PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)是最廣為研究的領(lǐng)域之一。程序性死亡受體1(Programmed cell death protein 1,PD-1)表達(dá)于活化T細(xì)胞表面，并能傳導(dǎo)免疫信號(hào)抑制T細(xì)胞的增殖、生存和效應(yīng)功能，影響T細(xì)胞的抗腫瘤效果。PD-1表達(dá)上調(diào)是T細(xì)胞活化的正常結(jié)果，也是終止免疫反應(yīng)所必須的，但其異常高表達(dá)會(huì)過度抑制T細(xì)胞活性，因此維持PD-1蛋白水平在合適范圍內(nèi)是非常重要的。PD-1的表達(dá)是被多層級(jí)調(diào)控的，目前在翻譯后水平調(diào)控方面，已知FBXO38能介導(dǎo)細(xì)胞表面的PD-1泛素化并通過泛素蛋白酶體途徑使其降解[1]，但不知道在被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面前，是否還有調(diào)控機(jī)制參與胞內(nèi)PD-1蛋白水平上的調(diào)控。此外，PD-1療法還面臨著耐藥性和低響應(yīng)率的問題。雖然5-FU與PD-1單抗聯(lián)合療法已被臨床前研究數(shù)據(jù)證明有效，但它的具體機(jī)制尚不清楚。

今年10月，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王嘉東教授、王巍教授團(tuán)隊(duì)和北京大學(xué)人民醫(yī)院申占龍教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在著名SCI期刊PNAS上發(fā)表了題為“KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression”的文章[2]，揭示了一種可在翻譯后水平上調(diào)控PD-1蛋白穩(wěn)態(tài)的相關(guān)蛋白：KLHL22。它能在PD-1被轉(zhuǎn)運(yùn)至T細(xì)胞表面前介導(dǎo)其降解；而KLHL22的缺乏可導(dǎo)致PD-1異常高表達(dá)，T細(xì)胞活性被過度抑制，抗腫瘤反應(yīng)降低。此外，該文章揭示化療藥物5-FU可通過抑制Klhl22轉(zhuǎn)錄來提高PD-1的表達(dá)量，從而增強(qiáng)5-FU和PD-1單抗聯(lián)合療法的效果。

KLHL22是一種主要的PD-1相關(guān)蛋白

為了探究蛋白質(zhì)水平上PD-1的調(diào)控因子有哪些，研究人員首先在穩(wěn)定表達(dá)PD-1的Jurkat細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞上進(jìn)行串聯(lián)親和純化/質(zhì)譜(Tandem affinity purification,TAP/MS)分析。在這兩種細(xì)胞的TAP/MS結(jié)果中，他們發(fā)現(xiàn)KLHL22蛋白都得到了較高的特異性富集(>10%)。接下來，他們又做了免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證KLHL22與PD-1間的結(jié)合作用，證明KLHL22是能與PD-1結(jié)合的蛋白質(zhì)。

圖1. KLHL22能與PD-1結(jié)合

KLHL22缺失導(dǎo)致PD-1蛋白量上升

E3連接酶能特異性識(shí)別并泛素化底物，而被泛素化的蛋白質(zhì)大部分都通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。而KLHL22是E3泛素連接酶BTB-CUL3-RBX1(BCR)復(fù)合體的一部分，因此，研究人員首先探究KLHL22能否影響PD-1降解。他們發(fā)現(xiàn)在Klhl22敲低的活化Jurkat細(xì)胞中，細(xì)胞表面PD-1蛋白水平升高，而PD-1在mRNA水平上并不受影響。此外，在Klhl22敲低的HEK293T細(xì)胞上也出現(xiàn)類似結(jié)果。為了進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，研究人員使用了賽業(yè)生物構(gòu)建的Klhl22敲除小鼠。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除Klhl22并不影響T細(xì)胞的發(fā)育、外周穩(wěn)態(tài)和活化。而且雖然編碼PD-1的Pdcd1基因在轉(zhuǎn)錄水平上并沒有發(fā)生變化，但Klhl22敲除小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表面PD-1蛋白水平上升。這些數(shù)據(jù)與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，說明Klhl22敲低導(dǎo)致了PD-1蛋白量上升。

圖2. Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表面PD-1蛋白水平

KLHL22在PD-1被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面前介導(dǎo)其降解

為了探究KLHL22介導(dǎo)的PD-1降解發(fā)生在哪個(gè)階段，研究人員使用了蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑brefeldin A(BFA)來處理穩(wěn)定表達(dá)PD-1的HEK293T細(xì)胞。BFA能特異性阻斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。研究人員發(fā)現(xiàn)，在Western Blot結(jié)果中，BFA處理組出現(xiàn)了一條代表未完全糖基化的小分子量PD-1條帶，且在Klhl22敲低的細(xì)胞中，未完全糖基化的PD-1蛋白比完全糖基化的PD-1蛋白濃度更高。此外，在小鼠模型上也有類似結(jié)果：與Klhl22 WT小鼠相比，Klhl22 KO小鼠體內(nèi)淋巴結(jié)CD3+T細(xì)胞的高爾基體提取物中，未完全糖基化的PD-1蛋白量明顯升高。這些結(jié)果顯示KLHL22與未完全糖基化的PD-1相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論，研究人員利用免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KLHL22和未完全糖基化的PD-1蛋白是否能相互結(jié)合。結(jié)果顯示，對(duì)比PD-L1，KLHL22和未完全糖基化的PD-1蛋白有更強(qiáng)的結(jié)合作用。此外，熒光檢測(cè)共定位結(jié)果也表顯示，BFA處理后，伴隨著細(xì)胞表面PD-1蛋白的信號(hào)消失，胞內(nèi)PD-1和KLHL22的重疊信號(hào)顯著增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)都說明KLHL22是在PD-1被完全糖基化并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面前介導(dǎo)其降解。

圖3. Klhl22和PD-1熒光檢測(cè)共定位

PD-1可被KLHL22/CUL3/RBX1泛素化

已知KLHL22是BCR E3泛素連接酶的底物特異性接頭蛋白，能特異性識(shí)別底物并介導(dǎo)其泛素化。研究發(fā)現(xiàn)，用蛋白酶體(Proteasome)抑制劑MG132處理穩(wěn)定表達(dá)PD-1的HEK293T細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)PD-1泛素化水平上升，而Klhl22敲低則顯著降低了PD-1的泛素化水平。此外，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在CUL3、RBX1都存在的情況下，相比于無處理的對(duì)照組以及使用了突變KLHL22Δ6K轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，BFA處理加上Klhl22 WT的轉(zhuǎn)染，能顯著提升了PD-1的泛素化水平。為了進(jìn)一步確認(rèn)PD-1泛素化位點(diǎn)，研究人員首先使用了UBPred數(shù)據(jù)庫來預(yù)測(cè)PD-1的賴氨酸殘基，并通過泛素化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)了K210和K233這兩個(gè)未完全糖基化的PD-1蛋白的泛素化位點(diǎn)。

圖4. KLHL22/CUL3/RBX1復(fù)合物能使PD-1泛素化.

KLHL22通過降解PD-1增強(qiáng)腫瘤免疫效果

為了探究KLHL22在腫瘤免疫中的作用，研究人員在Klhl22 KO小鼠和Klhl22 WT小鼠體內(nèi)分別接種了黑色素瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，與Klhl22 WT小鼠相比，Klhl22 KO小鼠的腫瘤演進(jìn)更快，且小鼠存活期更短。此外，Klhl22缺失不影響CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，或是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在腫瘤微環(huán)境中的比例，但腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表面的PD-1水平在Klhl22 KO小鼠內(nèi)明顯上升，并且能產(chǎn)生IFN-γ、TNF和顆粒酶B的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)量顯著下降，CD8+T細(xì)胞的增殖也受影響。這些結(jié)果顯示在Klhl22 KO小鼠的腫瘤微環(huán)境中，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞活性被過度抑制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Klhl22 KO是通過PD-1來發(fā)揮作用，研究人員在皮下接種了腫瘤的Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠上進(jìn)行了抗體阻斷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，PD-1抗體的加入顯著抑制了腫瘤增殖，消除了原本存在于Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠間的腫瘤生長差異。這些數(shù)據(jù)說明KLHL22的缺失能通過上調(diào)PD-1表達(dá)量使腫瘤浸潤T細(xì)胞活性被過度抑制。

圖5. PD-1抗體的加入消除了原本存在于Klhl22 WT和Klhl22 KO小鼠間的腫瘤生長差異

T細(xì)胞活化信號(hào)和腫瘤微環(huán)境能調(diào)控KLHL22的表達(dá)量

為了驗(yàn)證KLHL22能否被TCR激活信號(hào)調(diào)控從而維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，研究人員觀察了Klhl22在靜息態(tài)T細(xì)胞和活化T細(xì)胞的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞活化后，Klhl22的mRNA水平顯著提升。在加入了CD3/CD28抗體刺激的Jurkat細(xì)胞中也能發(fā)現(xiàn)相同的現(xiàn)象。此外，在結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)患者體內(nèi)，對(duì)比臨近的正常組織浸潤T細(xì)胞，腫瘤浸潤T細(xì)胞的KLHL22蛋白量大幅減少。這些結(jié)果顯示T細(xì)胞激活導(dǎo)致的KLHL22表達(dá)量上升是一個(gè)維持PD-1蛋白水平穩(wěn)態(tài)的機(jī)制；腫瘤微環(huán)境中這種機(jī)制的破壞是導(dǎo)致PD-1異常高表達(dá)和T細(xì)胞活性被過度抑制的原因之一。

圖6. 在臨近的正常組織浸潤T細(xì)胞和CRC腫瘤浸潤T細(xì)胞間KLHL22的表達(dá)差異

5-FU通過抑制Klhl22轉(zhuǎn)錄來提高PD-1表達(dá)量

有很多臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都表明化療藥物（例如5-FU）與PD-1單抗的聯(lián)合治療有協(xié)同效果，但具體機(jī)制仍不清楚。為了探究5-FU是否通過調(diào)控KLHL22表達(dá)從而影響PD-1，研究人員進(jìn)行了qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5-FU降低了Klhl22轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，并且可以在不影響PD-1 mRNA的水平上提高PD-1蛋白的表達(dá)量，而這種現(xiàn)象只在Klhl22 WT小鼠上出現(xiàn)。并且，5-FU對(duì)KLHL22蛋白表達(dá)量的抑制，PD-1蛋白表達(dá)量的提高呈現(xiàn)劑量依賴性。為了進(jìn)一步探究5-FU如何影響KLHL22，研究人員進(jìn)行了螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase Assay)。實(shí)驗(yàn)顯示Klhl22啟動(dòng)子上的一個(gè)小區(qū)域能有效啟動(dòng)Klhl22轉(zhuǎn)錄，且其轉(zhuǎn)錄活性在經(jīng)5-FU處理后顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明5-FU能通過抑制Klhl22轉(zhuǎn)錄來下調(diào)其表達(dá)量，從而提高PD-1表達(dá)量，增強(qiáng)PD-1單抗效果。該機(jī)制與來源于CRC患者的臨床數(shù)據(jù)相符。

圖7. Klhl22調(diào)控PD-1蛋白表達(dá)量

該文章揭示了胞內(nèi)PD-1蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面之前由KLHL22蛋白介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。KLHL22能識(shí)別未完全糖基化的PD-1，并介導(dǎo)其泛素化，使其通過泛素蛋白酶體途徑降解，從而維持PD-1在細(xì)胞表面的蛋白水平穩(wěn)態(tài)。此外，化療藥物5-FU處理可抑制KLHL22轉(zhuǎn)錄，提高PD-1的表達(dá)量，從而增強(qiáng)PD-1單抗的治療效果。綜上，該研究揭示了翻譯后水平調(diào)控PD-1蛋白水平穩(wěn)態(tài)的新機(jī)制，也為進(jìn)一步應(yīng)用發(fā)展5-FU和PD-1單抗聯(lián)合療法提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] X.Meng et al.,FBXO38 mediates PD-1 ubiquitination and regulates anti-tumour immunity of T cells.Nature 564:130–135(2018).

[2] X.A.Zhou et al.,KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression.PNAS 117(45):28239-28250(2020).

原文檢索：

[1] KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression.

DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2004570117.