Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins

2019 年 5 月 26 日，在Plant Biotechnology Journal 雜志發(fā)表了一篇論文" Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins  "，文章中將CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用于纖細裸藻中，為闡明其他微藻類的基因功能提供了一個突破。

纖細裸藻是一種單細胞光合鞭毛蟲，也是一種工業(yè)開發(fā)的微藻，它富含營養(yǎng)元素，積累大量的裸藻淀粉，具有多種生物活性功能。因此，大量培養(yǎng)的纖細裸藻是功能性食品、飼料和化妝品的商業(yè)來源。此外，在厭氧條件下，裸藻淀粉可被降解并轉(zhuǎn)化為主要由肉豆蔻酸和肉豆蔻醇組成的蠟酯。由于纖細裸藻產(chǎn)生的蠟酯很容易轉(zhuǎn)化為具有低冰點的生物燃料，因此它適合作為生物噴氣燃料的來源。

纖細裸藻（又名小眼蟲，Euglena  gracils）

在文章中，研究者為了在纖細裸藻中建立了一種基于Cas9核糖核酸蛋白（RNPs）的無轉(zhuǎn)基因誘變方法，在纖細裸藻葡聚糖合成酶2（EgGSL2）基因的第二個外顯子內(nèi)設(shè)計了兩個靶序列，他們推測該基因可能參與了裸藻淀粉的生物合成。使用NEPA GENE電轉(zhuǎn)儀將Cas9核糖核酸蛋白導(dǎo)入到纖細裸藻細胞中（圖1b）。實驗結(jié)果表明，這兩種以EgGSL2為靶點的RNPs可以使纖細裸藻細胞表現(xiàn)出更少但更大的裸澡淀粉顆粒。靶1和靶2表型改變的平均頻率分別為71.3%和80.6%(圖1d)，并且在電穿孔后72h檢測，插入缺失突變率分別為77.7-86.8%和88.8-90.1%（圖1g）。

纖細裸藻作為一種可再生資源具有很多優(yōu)異特性，但想要建立其有效靶向誘變一直是一個長期的挑戰(zhàn)。在這里，研究者利用CAS9 RNPS開發(fā)了一種高效的無轉(zhuǎn)基因靶向誘變和單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的基因敲入，這將為纖細裸藻是一種可編輯基因組的有機體提供了第一個證據(jù)，利用裸藻中所含的副淀粉和脂肪酸合成了生物塑料，為纖細裸藻開發(fā)應(yīng)用開拓了新方向，同時促進生物材料生產(chǎn)的可持續(xù)性發(fā)展。

摘取文獻:

NEPA21:

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NEPA21 采用全新的四步法電轉(zhuǎn)程序，配合專利的多脈沖、電壓衰減（Voltage Decay）和輔助基因?qū)�入模式設(shè)計，可在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時，提高細胞存活率 ，并且不需要特殊轉(zhuǎn)染試劑輔助。

NEPA21可實現(xiàn)懸浮細胞、貼壁細胞、受精卵、活體動物及離體組織器官的高效轉(zhuǎn)染，包括鼠、兔、魚、爪蟾\蝌蚪、蜜蜂、蟋蟀、蠶、水蚤、渦蟲等各種活體及受精卵胚胎的轉(zhuǎn)染，還可以用于植物種子、微藻等的電轉(zhuǎn)化。有250多種電極可供選擇，包括各種活體電極、離體電極、受精卵電極，以及貼壁細胞原位轉(zhuǎn)染的24孔板電極、96孔板電極等。
 

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