我們之前在Pall iCELLis®固定床生物反應(yīng)器中，以小規(guī)模和商品化規(guī)模，進行了病毒載體（慢病毒、腺病毒以及腺相關(guān)病毒）的生產(chǎn)。最近，一家名為Univercells的比利時公司推出了一種新型固定床生物反應(yīng)器，其具有相同的細胞生長表面基質(zhì)材料，但固定床結(jié)構(gòu)與iCELLis生物反應(yīng)器所使用的結(jié)構(gòu)不同。我們嘗試對這種新型scale-X hydro生物反應(yīng)器（2.4m2）和iCELLis Nano系統(tǒng)（2.67m2）進行一對一比較，以了解這種差別對細胞生長及慢病毒載體或腺病毒載體產(chǎn)量的影響。實驗運行使用在iCELLisNano生物反應(yīng)器中針對病毒載體生產(chǎn)而優(yōu)化的參數(shù)進行。細胞生長通過細胞核計數(shù)以及跟蹤葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生來監(jiān)測。在兩種生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，細胞生長良好，且發(fā)現(xiàn)scale-X生物反應(yīng)器中細胞分布相當均勻。結(jié)果證實，在慢病毒載體和腺病毒載體生產(chǎn)中，Univercells的scale-X生物反應(yīng)器至少可獲得同等效率，甚至更優(yōu)化�；�于這些結(jié)果，用于iCELLis生物反應(yīng)器中病毒載體生產(chǎn)的相同程序和參數(shù)也可成功用于scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的生產(chǎn)。
 
簡介
用于基因治療的病毒載體仍主要以貼壁細胞生產(chǎn)。標準的小規(guī)模生產(chǎn)依賴于不同的培養(yǎng)瓶方法，而規(guī)模放大選擇有，例如Cell Factories（細胞工廠，ThermoFisher Scientific）或Hyperstacks（Corning）。但是，這些方法需要大量的人工操作，可能需要開放式連接，且不能監(jiān)測或控制pH、溶氧等。所以，需要用于貼壁細胞的大規(guī)模、可拋棄型生物反應(yīng)器。ATMI/Pall在十多年前推出了iCELLis固定床生物反應(yīng)器。iCELLis Nano生物反應(yīng)器的三維固定床由數(shù)百根13.9 cm2的小尺寸聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）纖維（“載體”）組成，其裝填在生物反應(yīng)器內(nèi)。iCELLis生物反應(yīng)器提供高（144g/L）和低（96g/L）兩種壓縮結(jié)構(gòu)。iCELLis Nano生物反應(yīng)器的培養(yǎng)面積可達4.2m2，對于小規(guī)模批次來說，是非常有用的工具，但其主要用于工藝開發(fā)和優(yōu)化。iCELLis 500是商品化規(guī)模系統(tǒng)，根據(jù)固定床高度和載體壓縮程度，其培養(yǎng)面積范圍為66 – 500m2。我們是最早將iCELLis技術(shù)用于基于HEK293(T)貼壁系統(tǒng)，以進行腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）載體生產(chǎn)工藝的團隊之一。工藝開發(fā)在iCELLis Nano生物反應(yīng)器上進行，然后工藝規(guī)模放大至iCELLis 500規(guī)模，目前，我們已在iCELLis 500中生產(chǎn)了用于臨床試驗的病毒載體物料。我們每個批次可生產(chǎn)>1x10^16腺病毒顆粒。其它團隊也發(fā)現(xiàn)iCELLis生物反應(yīng)器可有效用于逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV、狂犬、甲肝以及基孔肯雅疫苗的生產(chǎn)，或以昆蟲細胞生產(chǎn)重組蛋白。iCELLis 500生物反應(yīng)器是一種符合GMP要求、完全可拋棄且可控的系統(tǒng)，并具有灌流能力。系統(tǒng)支持貼壁細胞生長和高滴度生產(chǎn)。
 
基于對iCELLis系統(tǒng)的專業(yè)知識，我們自然對Univercells新近推出的貼壁生物反應(yīng)器深感興趣。Univercells的scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)是一種自動化及一次性使用固定床生物反應(yīng)器，其培養(yǎng)面積范圍為2.4m2（商品名為hydro）至600m2（nitro）及以上。Univercells附有10-30m2“中型尺寸”scale-X carbo生物反應(yīng)器系統(tǒng)。到2020年，所有的scale-X生物反應(yīng)器可用于GMP生產(chǎn)。系統(tǒng)適合，例如，體外使用，特別是當產(chǎn)量要求低于直接將病毒載體注入患者體內(nèi)所需要求時。系統(tǒng)的固定床材料與iCELLis固定床相同，但是結(jié)構(gòu)不同。iCELLis固定床使用微載體相對隨機的填充，而在scale-X生物反應(yīng)器中，固定床是5cm2寬度的剛性聚丙烯篩網(wǎng)條帶和非編織親水性聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物交替螺旋管式組成的雙層的均一結(jié)構(gòu)，層間由間隔網(wǎng)隔開。這種結(jié)構(gòu)可在整個固定床中實現(xiàn)更好、更均勻的細胞分布。除了病毒載體生產(chǎn)外，scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)也可實現(xiàn)連續(xù)的在線濃度，因為系統(tǒng)可選擇內(nèi)置中空纖維切向流過濾模塊。通過將scale-X生物反應(yīng)器與NevoLine微型工廠結(jié)合，使用用于生物反應(yīng)器和在線下游處理的鏈式封閉柜體，可降低GMP設(shè)施要求。我們測試將這種新型scale-X hydro生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于慢病毒和腺病毒載體生產(chǎn)，以確定不同的膜基質(zhì)裝置是否會影響細胞生長或病毒載體產(chǎn)量，并將系統(tǒng)與iCELLis生物反應(yīng)器進行了比較。兩種生物反應(yīng)器系統(tǒng)使用此前在iCELLis生物反應(yīng)器上優(yōu)化的相同參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種生物反應(yīng)器中，細胞生長相似。Scale-X hydro生物反應(yīng)器中的產(chǎn)量至少與iCELLis Nano系統(tǒng)中的產(chǎn)量相當。
  
材料和方法
  
細胞系和培養(yǎng)基
 
293T（ATCC，Manassas，VA）和HEK293（ATCC）細胞培養(yǎng)在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）以及50-100 U/mL青霉素、50-100μg/mL鏈霉素（Gibco）和4mML-谷氨酰胺（Gibco）的高-或低-葡萄糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Paisley，United Kingdom/Sigma-Aldrich，Irvine，United Kingdom）中進行，用于慢病毒載體和腺病毒載體生產(chǎn)。此外，在慢病毒載體生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)染后（PT）培養(yǎng)基補充1x非基本氨基酸（Gibco）、1mM 丙酮酸鈉（Gibco）以及1:500 CD-脂質(zhì)添加物（Gibco）。FBS包含在生物反應(yīng)器接種前、細胞擴增時的起始培養(yǎng)基中以及直到轉(zhuǎn)染后24h的生物反應(yīng)器運行中，之后的運行不添加FBS。接種密度7,000 – 9,000 cells/cm2。接種前，所有細胞培養(yǎng)在+37℃、5%CO2濕化環(huán)境的T型瓶中。
 
用于慢病毒載體感染性滴度分析的HeLa細胞（ATCC）培養(yǎng)在DMEM-10%FBS（Gibco）-50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素（Gibco）中。轉(zhuǎn)導(dǎo)時不含F(xiàn)BS。
 
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反應(yīng)器中的慢病毒載體生產(chǎn)
 
總共進行4個scale-X生物反應(yīng)器運行。在3個運行中，生產(chǎn)慢病毒載體，另1個運行中，在轉(zhuǎn)染前，按Univercells提供的指導(dǎo)，對生物反應(yīng)器進行拆解，以分析固定床不同區(qū)域的細胞密度。一個iCELLis Nano生物反應(yīng)器作為對照，平行運行。
 
iCELLis Nano中的慢病毒載體生產(chǎn)使用2.67m2低壓縮固定床生物反應(yīng)器（Pall Life Sciences，Hoegaarden，Belgium）。在scale-X生物反應(yīng)器運行中，使用Univercells（Gosselies，Belgium）的2.4m2 scale-X hydro生物反應(yīng)器。運行按此前描述進行，使用灌流維持目標0.5g/L葡萄糖。葡萄糖和乳酸每天檢測1次或2次（Cedex-Bio，Roche，Mannheim，Germany）。接種后的1h，生物反應(yīng)器培養(yǎng)基取樣，對非貼壁的細胞進行計數(shù)。按此前報導(dǎo)，在第1-4天，對iCELLis Nano生物反應(yīng)器中貼附到載體的細胞進行細胞核計數(shù)。在scale-X hydro生物反應(yīng)器中，膜層間有采樣條（與iCELLis Nano生物反應(yīng)器中的載體尺寸大致相同），可與iCELLis Nano系統(tǒng)相似地進行取樣和細胞核計數(shù)。對于每個細胞核計數(shù)，使用無菌鑷子取兩根采樣條。此外，1個scale-X生物反應(yīng)器固定床拆解，對固定床頂部（距離頂部邊緣1cm）、中部和底物（距離底部邊緣1cm）、兩個膜層以及固定床的外、中和內(nèi)表面進行細胞核計數(shù)（圖1）。對于細胞核計數(shù)，從膜上裁1cm2小片。
 
在所有運行中，以1:1的DNA：PEIpro比例和200 ng/cm2質(zhì)粒（PlasmidFactory Bielefeld，Germany），使用PEIpro（Polyplus-transfection，Illkirch，France）–介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，生產(chǎn)三代LV-GFP。轉(zhuǎn)染按此前描述進行。
 
開始收獲前，進行完整的培養(yǎng)基置換，轉(zhuǎn)染后24– 72h，在室溫條件下，通過收集灌流培養(yǎng)基，收獲病毒載體。運行結(jié)束時，生物反應(yīng)器排放至相應(yīng)的收集袋中。
 
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反應(yīng)器中的腺病毒載體生產(chǎn)
 
總共進行了兩個生物反應(yīng)器運行，一個使用scale-X生物反應(yīng)器，一個使用iCELLis Nano系統(tǒng)，以比較腺病毒載體生產(chǎn)的差異。除與慢病毒運行一樣，通過灌流控制目標0.5g/L葡萄糖外，運行按此前描述進行。細胞接種密度為7,000 cells/cm2,。與慢病毒運行相似地，葡萄糖和乳酸每天檢測2次（Cedex-Bio），第1-4天進行細胞核計數(shù)。感染按之前描述進行，兩個生物反應(yīng)器使用相同的腺病毒載體（Ad-GFP）數(shù)量（平均感染復(fù)數(shù)值為75）。感染后68h，使用基于去垢劑的裂解方法進行細胞裂解。收獲物料使用0.027 m2深層濾器（Millipore，Billerica，MA）澄清。

  圖1. 拆解的Univercells scale-X hydro生物反應(yīng)器的細胞技術(shù)。從頂部（a）和側(cè)面（b）觀察的scale-X 生物反應(yīng)器示意圖。淡灰和深灰點指示用于細胞密度分析的取樣點。淡灰=內(nèi)側(cè)膜的取樣，深灰=外側(cè)膜層的取樣。對于細胞密度分析，對固定床頂部、中部和底物、卷膜的外表面、中部以及內(nèi)表面進行細胞核計數(shù)。示意圖下方表格中所示為細胞密度（cells/cm2）。

分析
 
慢病毒載體的感染性滴度（轉(zhuǎn)導(dǎo)單位[TU]/mL）使用基于定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qPCR）的方法確定。慢病毒載體顆粒（vp）滴度通過將p24酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA；PerkinElmer，Waltham，MA）的pg/mL結(jié)果轉(zhuǎn)換為vp/mL來分析，假定p24的1pg為12,500慢病毒顆粒。腺病毒載體顆粒滴度使用高效液相色譜（HPLC）分析。
 
結(jié)果和討論
 
ATMI/Pall大約在10年前推出了第一款全整合式、可拋棄型固定床生物反應(yīng)器iCELLis。此外，市面上也有一些其它公司開發(fā)的貼壁生物反應(yīng)器，如Celligen（NewBrunswick Scientific）、CellCube（Costar）、裝填床生物反應(yīng)器（BioBLU，Eppendorf）以及基于微載體的生物反應(yīng)器。在最近的創(chuàng)新產(chǎn)品中，還包括Univercells生產(chǎn)的scale-X生物反應(yīng)器，該公司由JoseCastillo聯(lián)合創(chuàng)立，他也是iCELLis系統(tǒng)的發(fā)明者之一。我們的團隊對于使用iCELLis生物反應(yīng)器進行病毒載體生產(chǎn)具有豐富的經(jīng)驗。由于iCELLis和scale-X生物反應(yīng)器中，用于細胞貼附的膜采用相同的材質(zhì)，我們假設(shè)在iCELLis生物反應(yīng)器中優(yōu)化和使用的參數(shù)可相當簡單地轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器。為測試這種假設(shè)，我們比較了scale-X生物反應(yīng)器和iCELLis Nano系統(tǒng)中的細胞生長、細胞分布、培養(yǎng)基消耗以及慢病毒和腺病毒載體生產(chǎn)。
 
細胞分布 
 
我們之前比較了iCELLis Nano生物反應(yīng)器高壓縮固定床（4m2）和低壓縮固定床（2.67m2）中的細胞分布，發(fā)現(xiàn)在低壓縮中，細胞分布更加均衡。在高壓縮固定床中，細胞分布有較大的差異，取決于計數(shù)的細胞來自哪一層（相比頂部，底部的細胞量要高3到4倍）。盡管在低壓縮固定床中，差異性較小，我們還是注意到，相比底部，低壓縮床中部的細胞量要高2到3倍。對拆卸的scale-X生物反應(yīng)器進行了細胞密度分析，以了解固定床不同部分中的細胞分布（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個固定床中，細胞分布相比均衡（圖1）。但是，當垂直或水平分析時，固定床中部的細胞密度要高約2倍，這與低壓縮iCELLis生物反應(yīng)器中的結(jié)果較為接近。當對雙層膜的外膜和內(nèi)膜進行細胞密度分析時，發(fā)現(xiàn)差異很小。這可能是由于scale-X生物反應(yīng)器固定床的卷式膜樣結(jié)構(gòu)形成了批次間細胞密度以及細胞生長更低的變異性。相比scale-X生物反應(yīng)器，iCELLis生物反應(yīng)器中，特別是在高壓縮固定床中，細胞密度更高的變異性，可能是由于載體相對隨機且緊實的填充。所以，在iCELLis生物反應(yīng)器中，由于存在一些低致密和高致密區(qū)域，每個反應(yīng)器之間總是有差異。
  
此外，在拆解前，對拆解的生物反應(yīng)器的采樣條進行取樣，計算密度為~1.1x10^5cells/cm2，接近膜頂-中部的密度（1.2x10^5±0.4x10^4）。所以，可見scale-X生物反應(yīng)器中的采樣條具有代表性，可用于評估細胞密度。
 
細胞生長
 
對于iCELLis Nano系統(tǒng)，我們優(yōu)化了接種使用的細胞密度，所以，在第0天，對照的Nano系統(tǒng)以7,000 293T cells/cm2的密度接種。對于scale-X生物反應(yīng)器，使用兩種不同接種密度，7,000 cells/cm2（scale-X生物反應(yīng)器運行1-3）以及9,000 cells/cm2（scale-X生物反應(yīng)器運行4）。在兩種生物反應(yīng)器中，細胞均可很快貼附至PET內(nèi)層，因為接種后1h，生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基取樣中，未發(fā)現(xiàn)游離細胞。感染時的目標細胞密度為150,000-200,000 cells/cm2，且通常，在iCELLis Nano運行中，該密度可在4天內(nèi)達到。為監(jiān)測細胞生長，iCELLis Nano和scale-X生物反應(yīng)器可在層流罩內(nèi)打開，使用無菌鑷子從生物反應(yīng)器夾取載體（Nano 生物反應(yīng)器）或采樣條（scale-X 生物反應(yīng)器）。重要的是，在scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)更大尺寸的固定床中，也可以通過采樣條取樣，而iCELLis 500生物反應(yīng)器中的載體不能取樣。
 
計算在第1-4天（轉(zhuǎn)染前）從生物反應(yīng)器固定床頂部取樣的載體/采樣條的細胞核，并轉(zhuǎn)換為細胞密度（圖2a）。scale-X生物反應(yīng)器運行3中達到目標細胞密度，scale-X生物反應(yīng)器運行1和2接近達到目標細胞密度。scale-X 運行4中更高的接種細胞密度導(dǎo)致轉(zhuǎn)染時的細胞密度過高�？赡苁怯捎谡�合固定床中不均勻的細胞分布，對照Nano運行也超過了目標細胞密度。
 
葡萄糖和培養(yǎng)基消耗
 
在所有運行中，使用灌流提供新鮮培養(yǎng)基。目標是通過使用高-葡萄糖DMEM作為灌流培養(yǎng)基，而維持生物反應(yīng)器中0.5g/L的葡萄糖濃度。為調(diào)節(jié)灌流速率，每天從生物反應(yīng)器培養(yǎng)基取樣監(jiān)測葡萄糖和乳酸濃度（圖2b、c）。盡管在scale-X生物反應(yīng)器運行1和2中，培養(yǎng)基和葡萄糖消耗低于標準iCELLis Nano運行，在運行3和4中，葡萄糖和培養(yǎng)基消耗在iCELLis Nano范圍內(nèi)（圖3）。值得考慮的是，在運行4中，相比其它運行，接種使用了更高的cells/cm2值。當計算感染前數(shù)值時，相比對照或標準iCELLis Nano運行，所有scale-X運行中的細胞特異性葡萄糖消耗最多可降低4倍（圖3i）。如果考慮到細胞密度在轉(zhuǎn)染后不發(fā)生變化，則可以評估收獲前的細胞特異性葡萄糖消耗（圖3j）。相比標準iCELLis Nano運行，scale-X生物反應(yīng)器運行中的細胞特異性葡萄糖消耗低達3倍。但是，這必須考慮到兩種生物反應(yīng)器類型中，整個固定床內(nèi)不同的細胞密度，而且細胞特異性葡萄糖消耗僅根據(jù)采取的頂部載體進行計算。這反應(yīng)了scale-X生物反應(yīng)器中更低的培養(yǎng)基/葡萄糖消耗。特別是，如果在24hPT前，灌流速率降低，成本可進一步降低，因為需要的昂貴FBS的體積更�。ㄔ谖覀兊姆桨钢校瑥�24h PT開始，F(xiàn)BS不用于灌流培養(yǎng)基）。此外，灌流中更低的培養(yǎng)基消耗可降低收獲液體積，這有益于下游工藝處理。Scale-X生物反應(yīng)器中更低的葡萄糖/培養(yǎng)基消耗的原因只能推測，但部分可能是由于scale-X中更加均勻的固定床結(jié)構(gòu)。而且，在scale-X生物反應(yīng)器中，循環(huán)的培養(yǎng)基可能可更加均等地達到細胞。
 
基于iCELLis Nano和scale-X中的總培養(yǎng)基消耗，如果直接放大至含有333m2固定床的iCELLis 500，灌流總共將使用大概~150L培養(yǎng)基，而含有600m2固定床的scale-X nitro中消耗的體積將為670 至940L。
  圖2. scale-X hydro生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運行中的細胞密度以及葡萄糖和乳酸濃度。（a）第0-4天，計算的固定床頂部的細胞密度（cells/cm2）；第0-7天，（b）葡萄糖和（c）乳酸濃度。對照Nano = Nano運行，運行與scale-X生物反應(yīng)器運行一起進行。標準Nano = 5個標準Nano運行的平均值。Scale-X 1-4 = scale-X生物反應(yīng)器運行1-4。
  圖3. scale-X hydro 生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運行中，培養(yǎng)基和葡萄糖消耗的散點印跡圖。（a、b）轉(zhuǎn)染前的培養(yǎng)基消耗，以mL（a）和μL/cm2（b）為單位；（c、d）收獲前運行中總培養(yǎng)基消耗，以mL（c）和μL/cm2（d）為單位；（e、f）轉(zhuǎn)染前的葡萄糖消耗，以g（e）和mg/cm2（f）為單位；（g、h）收獲前的總葡萄糖消耗，以g（g）和mg/cm2（h）為單位；（i、j）轉(zhuǎn)染前（i）和收獲前（j）的細胞特異性葡萄糖消耗，以pmol/cell/day為單位，考慮轉(zhuǎn)染后，細胞密度不增加。標準Nano=5個用于慢病毒載體生產(chǎn)的iCELLis Nano運行，對照Nano=與scale-X生物反應(yīng)器運行一同進行的運行。Scale-X 1-4=scale-X生物反應(yīng)器運行1-4，其中，運行1未轉(zhuǎn)染，而在第4天停止運行并拆解固定床。對于每個運行，標準Nano運行標識為獨立的點；此外，顯示SEM和中位數(shù)。SEM，標準平均誤差。
 
在iCELLis Nano和scale-X生物反應(yīng)器中的慢病毒載體產(chǎn)量
 
在scale-X生物反應(yīng)器和對照/標準Nano運行中，以p24 ELISA分析的病毒顆粒滴度以及以基于qPCR的方法分析計算的感染性滴度均在相同的范圍內(nèi)（圖4a-d）。在獨立的分析中分析的感染性滴度不能可靠地相互比較，但是，如滴度檢測同時進行，則可以進行比較。對照Nano和scale-X生物反應(yīng)器運行3和4同時進行滴度檢測，在這些運行中，scale-X生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)的TU幾乎是iCELLis Nano運行的兩倍多。由于scale-X生物反應(yīng)器中的固定床尺寸相比iCELLis Nano小，所有每cm2的TU差異更大（圖4d）。在所有的運行中，VP產(chǎn)量彼此接近（圖4a、b），所以，基于這些運行，scale-X生物反應(yīng)器運行3中的vp/TU比（vp/TU：652）好于iCELLis Nano（vp/TU：1339）生物反應(yīng)器。但是，在轉(zhuǎn)染過程中，按細胞核計數(shù)，iCELLis Nano生物反應(yīng)器中的細胞密度約為目標的兩倍。由于接種的細胞量與標準運行相同，所以可能的解釋是固定床中細胞的不均勻分布，其可能降低了轉(zhuǎn)染效率，進而影響產(chǎn)量。如scale-X生物反應(yīng)器運行4當中所見，至少接種9,000 cells/cm2更高的細胞密度時，不會提高產(chǎn)量，7,000 cells/cm2似乎是scale-X生物反應(yīng)器中的最佳接種密度。由于所有scale-X生物反應(yīng)器運行中的產(chǎn)量與iCELLis Nano（對照和標準運行）相比，至少相似或甚至更高，所以iCELLis Nano生物反應(yīng)器中使用的參數(shù)可相對簡單地轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器，而不需要針對另一種固定床進行參數(shù)優(yōu)化。但是，優(yōu)化后可能可進一步提高滴度。
 
我們之前注意到，相比低壓縮的固定床，在高壓縮固定床進行生產(chǎn)時，每cm2的慢病毒載體產(chǎn)量要低。在2.67m2低壓縮固定床的iCELLis Nano生物反應(yīng)器生產(chǎn)的病毒載體量與4m2高壓縮固定床中的產(chǎn)量相同。此外，使用低壓縮固定床時，培養(yǎng)基消耗更低，且更容易預(yù)測。所以，使用當前的iCELLis 500，理論上可達到1-2x10^12TU（使用qPCR方法，在HeLa細胞中進行滴度檢測）或1-3x10^15VP（病毒顆粒）的總產(chǎn)量。目前，最大的低壓縮iCELLis固定床尺寸為333m2。對于scale-X生物反應(yīng)器，其只提供一種壓縮。根據(jù)scale-X生物反應(yīng)器生產(chǎn)商的信息，其可提供的最大固定床尺寸至少為600m2。所以，如果使用scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)，進行直接規(guī)模放大，iCELLis生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的病毒載體量至少可以翻倍，甚至翻三倍。但是，我們發(fā)現(xiàn)，盡管iCELLis生物反應(yīng)器系統(tǒng)應(yīng)該可以直接規(guī)模放大，但是出于未知的原因，當慢病毒載體生產(chǎn)從iCELLis Nano規(guī)模放大到iCELLis 500規(guī)模（使用100或333m2）時，相比小規(guī)模，每m2生產(chǎn)的病毒載體更多，而在大規(guī)模中，每m2消耗的培養(yǎng)基更少。所以，如果大規(guī)模中的產(chǎn)量提升與生物反應(yīng)器固定床的組成無關(guān)，而與其它大規(guī)模工藝參數(shù)相關(guān)，如無抗生素生產(chǎn)，而相同的情況也發(fā)生在大規(guī)模scale-X生物反應(yīng)器中，則scale-X nitro 生物反應(yīng)器中可能可達到超于>1x10^13 TU（在我們的HeLa細胞中進行滴度檢測）或超于 >1x10^16vp。
 
由于iCELLis和scale-X生物反應(yīng)器均旨在貼壁使用，所有其可放大性確實有限。使用懸浮生物反應(yīng)器時，可放大性限制較少，例如，使用2,000L懸浮生物反應(yīng)器可極大地提高產(chǎn)量。目前，很多慢病毒載體批次，甚至是用于臨床試驗時，仍使用細胞工廠、3L攪拌罐或僅達50L的波浪式生物反應(yīng)器或攪拌罐進行生產(chǎn)。但是，僅有極少數(shù)的病毒載體生產(chǎn)商報導(dǎo)了更大的懸浮生物反應(yīng)器的使用。在貼壁生物反應(yīng)器中，如iCELLis和scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)，可通過灌流，簡單地提供新鮮的培養(yǎng)，并去除用過的培養(yǎng)基。由于慢病毒載體生產(chǎn)后進入培養(yǎng)基，灌流可以簡單地收集病毒載體，并實現(xiàn)連續(xù)的下游工藝處理。盡管懸浮生物反應(yīng)器有灌流選項，懸浮中的灌流仍處于其早期研發(fā)階段，且用于慢病毒載體生產(chǎn)的合適灌流設(shè)備仍需要在臨床/商品化規(guī)模中進行優(yōu)化或證實。此外，懸浮生物反應(yīng)器中的泡沫形成對于病毒載體生產(chǎn)是個不小的問題。而且，在無血清培養(yǎng)基中生長的細胞或甚至是適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細胞，仍可在固定床生物反應(yīng)器中生長，因為細胞不管怎樣都會被截留在固定床的膜結(jié)構(gòu)中。所以，簡單且溫和的灌流以及不需要額外設(shè)備的優(yōu)勢，也可使用固定床生物反應(yīng)器在無血清條件下以及懸浮馴化細胞中進行探索。
 
使用我們目前的參數(shù)，當規(guī)模放大至scale-X nitro生物反應(yīng)器（600m2）時，根據(jù)灌流速率，理論上可生產(chǎn)400 至 600L的慢病毒載體，且病毒產(chǎn)量超于 >10^6 TU/mL（使用我們的HeLa細胞系進行滴度檢測）和超于 >10^9 vp/mL。這與使用補料分批的200L 攪拌罐生物反應(yīng)器相當，其可達到0.5-5x10^7TU/mL感染性滴度。但是，由于沒有慢病毒載體參考標準，實驗室和生產(chǎn)站點間的感染性滴度不能進行完全的比較。此外，通常情況下，貼壁細胞中的慢病毒載體產(chǎn)率高于懸浮生產(chǎn)。這可能是由于不同的細胞培養(yǎng)基，因為特定的培養(yǎng)基相比其它培養(yǎng)基，可更好地支持轉(zhuǎn)染，獲得更高的產(chǎn)量。也可能部分是由于FBS的存在，其仍常用于貼壁細胞生產(chǎn)（在我們的整體方案中，直到轉(zhuǎn)染后24h前使用）。此外，不是所有用于生產(chǎn)慢病毒的載體都可在懸浮培養(yǎng)中良好生長。大體積的慢病毒載體收獲液可能難以進行下游處理。每個慢病毒載體生產(chǎn)商都應(yīng)該考慮下需要多大體積的載體以及如何簡單且快速地對易碎的慢病毒進行下游處理。即使下游工藝處理之后的收率僅為10%，以scale-X nitro（600m2）生物反應(yīng)器生長的病毒載體的量，根據(jù)目的應(yīng)用，已經(jīng)可以達到數(shù)百至數(shù)千的劑量。但是，對于其它病毒載體的生產(chǎn)，例如AAV，還是需要更大的生物反應(yīng)器，因為每個患者需要的病毒載體的數(shù)量通常高于慢病毒載體。
  圖4. scale-X hydro生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運行中的慢病毒載體產(chǎn)量。（a、b）scale-X生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運行中，分別生產(chǎn)的總慢病毒顆粒（vp）和vp/cm2。（c、d）scale-X生物反應(yīng)器和iCELLis Nano生物反應(yīng)器運行中，分別生產(chǎn)的總TU和TU/cm2。對照Nano = Nano 運行，與scale-X生物反應(yīng)器運行一同進行。標準Nano = 5個標準Nano運行的平均值。scale-X 1-4=scale-X生物反應(yīng)器運行1-4。平均值±SEM。TU，轉(zhuǎn)導(dǎo)單位；VP，載體顆粒。
 
在iCELLis Nano和scale-X生物反應(yīng)器中進行腺病毒載體生產(chǎn)
 
除了慢病毒載體之外（圖4），我們也比較了在iCELLis生物反應(yīng)器和scale-X生物反應(yīng)器中進行的腺病毒載體的生產(chǎn)。使用HPLC分析scale-X hydro系統(tǒng)和iCELLis Nano生物反應(yīng)器生產(chǎn)的AdGFP的滴度。澄清后，scale-X生物反應(yīng)器運行獲得的滴度為每毫升1.11x10^11病毒顆粒，iCELLis Nano運行為每毫升8.53x10^10顆粒。結(jié)果說明，scale-X生物反應(yīng)器也可用于腺病毒載體的生產(chǎn)，且獲得與iCELLis系統(tǒng)相當?shù)母弋a(chǎn)量。
 
結(jié)論
 
Univercells的scale-X固定床生物反應(yīng)器證實可高效用于病毒載體生產(chǎn)。通過細胞核計數(shù)、葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)，監(jiān)測細胞生長。補液策略基于灌流。在scale-X生物反應(yīng)器中，細胞生長良好，且在整個螺旋纏繞管式固定床中，細胞分布相對均勻。慢病毒載體可在scale-X hydro系統(tǒng)中高效生產(chǎn)，與iCELLis Nano相比，scale-X生物反應(yīng)器中生產(chǎn)的慢病毒載體產(chǎn)量相似甚至更高（總量為2.4x10^10 TU，即9.8 x 10^5 TU/cm2）。在對照的iCELLisNano中，獲得的產(chǎn)量為1.3x10^10TU（4.7x10^5TU/cm2），而在標準的iCELLis Nano中，為1.7x10^10±SD 8.7x10^9TU（=6.4x10^10±SD 3.4x10^5TU/cm2）。此外，腺病毒載體產(chǎn)量在兩種生物反應(yīng)器中相似，iCELLis Nano為8.53x10^10 vp/mL，scale-X hydro為1.11x10^11vp/mL。所以，可見，iCELLis生物反應(yīng)器中用于病毒載體生產(chǎn)的參數(shù)可直接轉(zhuǎn)移到scale-X生物反應(yīng)器上，反之亦然。
 
原文翻譯：H.M.Leinonen, S.Lepola, E.M.Lipponen, et al., Benchmarking of Scale-X Bioreactor System in Lentiviral and Adenoviral Vector Production. Human Gene Therapy, 2020, 31(5&6) : 376 – 384.
    
PEIpro® 系列產(chǎn)品，是專門為基因和細胞治療市場設(shè)計開發(fā)的專有轉(zhuǎn)染產(chǎn)品，是獲得可靠的病毒載體生產(chǎn)和高感染滴度的首選轉(zhuǎn)染方法，且從工藝開發(fā)到大規(guī)模臨床級的病毒生產(chǎn)可直接放大和無縫過渡，在各種生產(chǎn)細胞中病毒產(chǎn)量最高。PEIpro® 完全克服了未經(jīng)提純和優(yōu)化的原始PEI的缺點，遵循非常嚴格的質(zhì)量控制和法律法規(guī)。PEIpro® 有3個質(zhì)量等級的產(chǎn)品：研發(fā)級的PEIpro®用于工藝開發(fā)，更高質(zhì)量等級的PEIpro®-HQ用于臨床前研究和早期臨床試驗，最高質(zhì)量等級PEIpro®-GMP用于臨床試驗及商業(yè)化階段。
 
詳情請查閱官網(wǎng)：https://www.polyplus-transfection.com
 
Polyplus聯(lián)系人：劉海芹，商務(wù)經(jīng)理，hliu@polyplus-transfection.com
Polyplus技術(shù)支持：support@polyplus-transfection.com