摘要 
埃博拉病毒病(EVD)是一種致命性疾病，近年來(lái)偶發(fā)于非洲大陸，并導(dǎo)致嚴(yán)重的疫情。rVSV-ZEBOV是一種重組水泡口炎病毒結(jié)構(gòu)，其中的天然病毒糖蛋白替換為埃博拉病毒(Zaire)糖蛋白。免疫被認(rèn)為是預(yù)防這種高傳染性疾病最有效的方法。所以，迫切需要開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)高效且可放大的疫苗生產(chǎn)工藝，以使疫苗可大規(guī)模使用。貼壁細(xì)胞被廣泛用于疫苗的開(kāi)發(fā)和商品化生產(chǎn)。由于生物工藝行業(yè)近來(lái)的發(fā)展，對(duì)病毒性疫苗有很大的需求，超過(guò)了當(dāng)前的生產(chǎn)能力。但是，使用傳統(tǒng)技術(shù)(如攪拌罐、靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng))進(jìn)行病毒疫苗的生產(chǎn)會(huì)有一定的局限性，如有限的可放大性、靈活性以及較高的生產(chǎn)成本。Univercells Technologies開(kāi)發(fā)了一種可規(guī)模放大的新型固定床生物反應(yīng)器，可幫助以可負(fù)擔(dān)的形式，為市場(chǎng)提供所需數(shù)量的疫苗產(chǎn)品。在本研究中，將rVSV-ZEBOV的Vero細(xì)胞無(wú)血清生產(chǎn)工藝從微載體攪拌罐生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移到了Univercells Technologies的scale-X™固定床生物反應(yīng)器。我們證實(shí)，固定床生物反應(yīng)器培養(yǎng)可獲得均勻的細(xì)胞分布，以及感染性病毒顆粒更高的細(xì)胞特異性產(chǎn)率。此外，將細(xì)胞培養(yǎng)工藝從攪拌罐生物反應(yīng)器成功轉(zhuǎn)移到固定床生物反應(yīng)器，可較低設(shè)備占地，并實(shí)現(xiàn)更具成本效益的生產(chǎn)。
 
1. scale-X™一次性使用固定床生物反應(yīng)器 2. 工藝設(shè)置

細(xì)胞系 & 病毒: 貼壁Vero細(xì)胞系源于 ATCC CCL-81.5 & 使用病毒為VSV-ZEBOV。
實(shí)驗(yàn)# 1: 比較微載體和固定床中的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)，并評(píng)估固定床中的細(xì)胞均質(zhì)性。
 
STR中的微載體培養(yǎng): 生物反應(yīng)器培養(yǎng)在1L生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行(Applikon Biotechnology)。生物反應(yīng)器中的微載體濃度為2 g/L。使用VP-SFM+ 4mM L-谷氨酰胺培養(yǎng)基，并添加 0.1%泊洛沙姆199。接種密度22,700 cells/cm²，工作體積850 mL。
 
scale-X™ hydro 生物反應(yīng)器培養(yǎng): 生物反應(yīng)器培養(yǎng)在2.4m² hydro 生物反應(yīng)器中進(jìn)行。使用VP-SFM+ 4mM L-谷氨酰胺培養(yǎng)基。接種液工作體積700mL，密度約為11,458 cells/cm²。循環(huán)使用2L體積，以10mL/min的流速進(jìn)行。
 
實(shí)驗(yàn)# 2: 評(píng)估固定床vs微載體中的VSV-ZEBOV生產(chǎn)。細(xì)胞以與微載體生物反應(yīng)器(22,727 cells/cm² ) 相似的細(xì)胞密度接種固定床(22,708 cells/cm² ) ，生物工藝以相同的方式進(jìn)行，工藝參數(shù)維持為相同的設(shè)定點(diǎn)。在相同的3天細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間后，以MOI 0.01，感染rVSV-ZEBOV。
   
3. 結(jié)構(gòu)化固定床中均勻的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)

微載體生物反應(yīng)器和scale-X™ hydro固定床生物反應(yīng)器中的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)相當(dāng)。不同的細(xì)胞接種濃度導(dǎo)致了略有偏移但相當(dāng)?shù)纳�長(zhǎng)趨勢(shì)。scale-X™生物反應(yīng)器中的單位面積細(xì)胞濃度(2.7x 10⁵   cells/cm² )稍高于微載體培養(yǎng)(2.4 x10⁵  cells/cm² )(圖4)。主要代謝底物濃度數(shù)據(jù)顯示，兩種系統(tǒng)中具有相似的生物動(dòng)力學(xué)。  
4. 病毒產(chǎn)量
 
在34°C 時(shí)，微載體生物工藝中的細(xì)胞密度在感染后不再繼續(xù)增加，但在固定床生物反應(yīng)器中，感染后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞密度沒(méi)有出現(xiàn)同樣的急劇下降 (圖6 & 7)。感染后24小時(shí)，達(dá)到最高感染性滴度1.95×10⁷ TCID50/mL，說(shuō)明，由于相比微載體系統(tǒng)，細(xì)胞被更緊實(shí)地填充在固定床中，從而可能可使病毒在該空間內(nèi)更容易地貼附到細(xì)胞，所以獲得了更快的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。此外，在感染后的前4小時(shí)，固定床單元和培養(yǎng)基瓶之間的培養(yǎng)液循環(huán)暫停。相比微載體生物反應(yīng)器，在該段時(shí)間內(nèi)，病毒的單位體積濃度可提高2.8倍。  
此外，相比微載體工藝中生產(chǎn)峰值時(shí)1130 VG/TCID50 的病毒基因組和感染性滴度比例，固定床生物反應(yīng)器中僅為101 VG/TCID50，說(shuō)明其生產(chǎn)的病毒質(zhì)量更好，從最高細(xì)胞密度看，固定床生物反應(yīng)器生產(chǎn)峰值時(shí)，可獲得 14.4 TCID50/cell和1459 VG/cell的比例。這表示相比微載體系統(tǒng)，固定床生物反應(yīng)器中感染性顆粒的細(xì)胞特異性產(chǎn)率可提高1.9倍。該工藝可進(jìn)一步優(yōu)化，以證實(shí)scale-X™平臺(tái)的可放大性。

5. 結(jié)論
scale-X™ hydro固定床生物反應(yīng)器可生產(chǎn)與微載體運(yùn)行相似的感染性滴度，但達(dá)到的生產(chǎn)時(shí)間更短。此外，固定床生物反應(yīng)器生產(chǎn)rVSV-ZEBOV的病毒基因組和感染性滴度比例更低，而感染性病毒顆粒的細(xì)胞特異性產(chǎn)率更高�？傮w結(jié)果顯示，當(dāng)工藝轉(zhuǎn)移至固定床scale-X™生物反應(yīng)器時(shí)，可獲得相似的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)和最高單位面積細(xì)胞濃度。最后，對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)分布的研究顯示，固定床內(nèi)有均勻的細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)。相比微載體工藝，固定床的緊湊設(shè)計(jì)可使設(shè)備占地降低5倍。結(jié)果同時(shí)顯示，結(jié)構(gòu)化scale-X™固定床生物反應(yīng)器不僅是替代傳統(tǒng)“規(guī)模擴(kuò)展”技術(shù)的合適方式，如多層培養(yǎng)皿和滾甁，也可替代技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)系統(tǒng)，如微載體工藝。


原文翻譯：S,Kiesslich, J.P.V.Losa, J.G´ elinas, et al., Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells: microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology, 2020, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.01.015.