脂肪酸（FA）在體內(nèi)具有重要功能，可作為能量來源，并參與生物膜合成和能量存儲。然而，脂肪酸如何跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，目前仍不太清楚。與葡萄糖和氨基酸不同，脂肪酸具有疏水性，這使得其運(yùn)動(dòng)難以追蹤。有人認(rèn)為，脂肪酸是經(jīng)過被動(dòng)擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，但越來越多的證據(jù)表明，脂肪酸是在蛋白的參與下完成代謝組織的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

 

在已知的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，CD36是研究相對較多的一個(gè)。它主要定位于細(xì)胞膜上的caveolae凹陷結(jié)構(gòu)，且脂肪酸吸收活性也依賴caveolae結(jié)構(gòu)。小鼠脂肪和肌肉組織中大約50%的脂肪酸吸收是由CD36貢獻(xiàn)的。CD36有一個(gè)脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)，但具體如何轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸，現(xiàn)在還是個(gè)謎。

 

復(fù)旦大學(xué)代謝與整合生物學(xué)研究院的趙同金課題組之前發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶DHHC4和DHHC5分別在高爾基體和細(xì)胞質(zhì)膜上對CD36進(jìn)行棕櫚�；�修飾，從而維持CD36的質(zhì)膜定位并促進(jìn)其脂肪酸吸收的活性。

 

最近，趙同金課題組與南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心的陳帥課題組合作，進(jìn)一步研究了CD36促進(jìn)脂肪酸吸收的方式。他們發(fā)現(xiàn)，脂肪酸可通過CD36介導(dǎo)的內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，而CD36的動(dòng)態(tài)棕櫚酰化在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。

 

CD36介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞

為了研究脂肪酸吸收期間CD36的亞細(xì)胞定位變化，研究人員用BSA偶聯(lián)的油酸處理3T3-L1脂肪細(xì)胞，并開展內(nèi)源性CD36的免疫染色。他們發(fā)現(xiàn)，從油酸處理后30分鐘開始，CD36被內(nèi)化并在細(xì)胞內(nèi)顯示出點(diǎn)狀信號。到1小時(shí)，CD36開始包裹脂滴，并在2小時(shí)和4小時(shí)變得更明顯。

 

由于CD36主要定位在caveolae凹陷結(jié)構(gòu)上，故研究人員也分析了caveolae結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin1（CAV1）的動(dòng)態(tài)定位。他們發(fā)現(xiàn)CAV1與CD36共同遷移�？紤]到CD36的脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)位于質(zhì)膜外側(cè)，而CAV1位于內(nèi)側(cè)，他們猜測CD36和CAV1在內(nèi)化時(shí)相互依賴，其中CD36作為受體接受脂肪酸的信號，而CAV1提供結(jié)構(gòu)上的支持。確實(shí)是這樣，當(dāng)脂肪細(xì)胞中的任一個(gè)被敲除時(shí)，另一個(gè)在油酸處理后也不再內(nèi)化，這表明它們的內(nèi)化源于CD36介導(dǎo)的caveolae內(nèi)吞作用。

 

之后，他們選擇PacFA作為脂肪酸類似物來追蹤脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。如圖1所示，PacFA是一種可以光活化的脂肪酸類似物，可參與點(diǎn)擊反應(yīng)。他們用PacFA處理脂肪細(xì)胞20分鐘，然后利用N3-Alexa Fluor 488開展點(diǎn)擊反應(yīng)以標(biāo)記PacFA，并對CD36進(jìn)行免疫染色。通過這種方式，他們觀察到了PacFA和CD36的清晰定位。在定量時(shí)，大約56%的PacFA與細(xì)胞內(nèi)部的CD36結(jié)合。

 

為了進(jìn)一步確認(rèn)CD36通過內(nèi)吞作用促進(jìn)脂肪酸吸收，研究人員試圖敲除CAV1，看看對內(nèi)吞作用的阻斷是否會(huì)破壞脂肪酸吸收。他們在Cav1−/−小鼠（賽業(yè)生物提供）、 Cd36−/−小鼠以及 Cav1−/−;Cd36−/−小鼠的脂肪細(xì)胞中開展3H-油酸吸收實(shí)驗(yàn)。與野生型脂肪細(xì)胞相比，Cav1−/−脂肪細(xì)胞中的3H-油酸吸收降低40%。同時(shí)，雙重敲除并沒有進(jìn)一步降低3H-油酸的吸收，表明caveolar內(nèi)吞是CD36依賴的脂肪酸吸收所必需的。

圖1. CD36介導(dǎo)的caveolar內(nèi)吞將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞

 

CD36的動(dòng)態(tài)棕櫚�；�是脂肪酸吸收所必需的

之后，研究人員想了解CD36如何從質(zhì)膜上解離。由于CD36的質(zhì)膜定位需要棕櫚�；�，因此他們想看看CD36在內(nèi)化之前是否會(huì)去棕櫚酰化。在油酸處理后5分鐘內(nèi)，CD36的棕櫚�；�水平開始降低，并在30-60分鐘左右達(dá)到最低點(diǎn)。DHHC5的棕櫚酰化也有類似的觀察結(jié)果。從培養(yǎng)基中去除油酸時(shí)，CD36和DHHC5被重新棕櫚�；�，這表明CD36和DHHC5在脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)吞過程中經(jīng)歷了棕櫚�；�的動(dòng)態(tài)變化。

 

接著他們解析了CD36內(nèi)吞的信號通路。首先鑒定了CD36的去棕櫚酰化酶，目前主要有五種，包括APT1、APT2和ABHD17A–C。通過PalmB抑制等實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)APT1是CD36的去棕櫚酰化酶。然后，他們敲除了3T3-L1脂肪細(xì)胞中的APT1或采用APT1抑制劑處理，發(fā)現(xiàn)APT1的敲除或抑制均可阻斷油酸誘導(dǎo)的CD36內(nèi)化和去棕櫚酰化（圖2）。

圖2. CD36的去棕櫚�；�是脂肪酸內(nèi)吞所必需的

 

那么是什么導(dǎo)致了CD36的去棕櫚�；�。研究人員猜想，DHHC5可能被滅活，因?yàn)镈HHC的自身棕櫚�；�是催化底物棕櫚�；�的第一步。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，在油酸處理5分鐘后，DHHC5上Tyr91位點(diǎn)的磷酸化顯著增加，而30分鐘后降至基底水平。他們還證實(shí)，DHHC5的動(dòng)態(tài)失活是CD36內(nèi)化所必需的。

 

于是，下一個(gè)目標(biāo)是鑒定將DHHC5磷酸化的激酶。他們敲除了3T3-L1脂肪細(xì)胞中豐度相對較高的四個(gè)Src家族激酶（SFK），發(fā)現(xiàn)LYN的敲除可抑制油酸誘導(dǎo)的DHHC5磷酸化。利用兩個(gè)shRNA敲除LYN后，油酸誘導(dǎo)的CD36內(nèi)化以及CD36和DHHC5的去棕櫚酰化被阻斷，證實(shí)LYN可在Tyr91位點(diǎn)將DHHC5磷酸化。

 

不過，CD36的去棕櫚�；�如何啟動(dòng)內(nèi)吞作用呢？研究人員首先研究了dynamin、VAV和JNK的招募，這些蛋白曾被報(bào)道參與了CD36的內(nèi)吞作用。利用各個(gè)蛋白的抑制劑處理后，他們發(fā)現(xiàn)所有抑制劑均能阻斷油酸誘導(dǎo)的CD36內(nèi)吞作用。同時(shí)，油酸處理導(dǎo)致VAV和JNK的磷酸化增加，表明CD36的去棕櫚酰化需要招募這些蛋白。

 

通過進(jìn)一步的研究，他們發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶SYK在油酸處理后被激活，并招募到質(zhì)膜上。SYK抑制劑（piceatannol）的處理在很大程度上消除了油酸誘導(dǎo)的VAV和JNK磷酸化以及CD36的內(nèi)化，但并不影響CD36去棕櫚酰化，表明SYK激活是CD36去棕櫚�；�的下游事件。SYK將VAV和JNK磷酸化，從而啟動(dòng)CD36介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。

 

內(nèi)吞作用的阻斷可抑制CD36的生理功能

最后，研究人員評估了CD36介導(dǎo)的脂肪酸內(nèi)吞有何生理意義。由于脂肪酸吸收的主要功能是將脂肪酸儲存在脂肪細(xì)胞的脂滴中，因此他們探討了內(nèi)吞作用的阻斷對脂滴生長有何影響。與野生型脂肪細(xì)胞不同，Cd36−/−脂肪細(xì)胞經(jīng)過油滴處理后幾乎沒有明顯的脂滴生長，表明內(nèi)吞作用的阻斷可以消除CD36依賴性的脂滴生長。此外，通過靶向LYN或SYK來阻斷內(nèi)吞作用，也能夠抑制飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的體重增加。

 

最后，研究人員評估了CD36介導(dǎo)的脂肪酸內(nèi)吞有何生理意義。由于脂肪酸吸收的主要功能是將脂肪酸儲存在脂肪細(xì)胞的脂滴中，因此他們探討了內(nèi)吞作用的阻斷對脂滴生長有何影響。與野生型脂肪細(xì)胞不同，Cd36−/−脂肪細(xì)胞經(jīng)過油滴處理后幾乎沒有明顯的脂滴生長，表明內(nèi)吞作用的阻斷可以消除CD36依賴性的脂滴生長。此外，通過靶向LYN或SYK來阻斷內(nèi)吞作用，也能夠抑制飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的體重增加。

圖3. CD36介導(dǎo)的caveolar內(nèi)吞促進(jìn)脂肪酸吸收的工作模型

 

原文檢索：

Hao, J., Wang, J., Guo, H. et al. CD36 facilitates fatty acid uptake by dynamic palmitoylation-regulated endocytosis. Nat Commun 11, 4765 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18565-8.

 

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