再登Nature Genetics-ecDNA與致ai基因擴增及多種ai癥不良預(yù)后相關(guān)
文章導讀
研究發(fā)現(xiàn)，許多擴增的原ai基因，并不只是位于染色體，而且還能變成游離的染色體外DNA（ecDNA），并出現(xiàn)大量拷貝，而且相當高比例的ecDNA是以環(huán)狀DNA分子的形式存在，即eccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）。由于ecDNA不存在著絲粒，所以在細胞有絲分裂時，無法被均等地分配到兩個母細胞中，這就導致ecDNA的拷貝數(shù)會隨著細胞代數(shù)的增加而呈現(xiàn)巨大的異質(zhì)性，從而驅(qū)動腫 瘤演化過程，但是關(guān)于ecDNA發(fā)生頻率和臨床影響尚不清楚。
2020年8月17日發(fā)表在Nature genetic（IF=27.603）上的一篇題為《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》的文章揭示了ecDNA與致ai基因擴增及多種ai癥的不良預(yù)后間的相關(guān)性。通過對3212名ai癥患者的全基因組測序數(shù)據(jù)的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ecDNA擴增通常發(fā)生在大多數(shù)ai癥類型中；與線性DNA相比，ecDNA擴增而引起的ai基因轉(zhuǎn)錄水平更高，同時染色質(zhì)的可及性得到增強，能夠更頻繁地與轉(zhuǎn)錄本融合；攜帶ecDNA的ai癥患者的生存期也明顯短于非ecDNAai基因擴增引起的ai癥患者。此次研究結(jié)果表明，基于ecDNA的ai基因擴增在ai癥中普遍存在，并導致許多ai癥類型的患者預(yù)后不良。
實驗方法：Circle-Seq，全基因組測序，ATAC-seq
文章鏈接：《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》
研究內(nèi)容
1.eccDNA擴增廣 泛存在于各類ai癥類型中
ai基因擴增是ai細胞中常見的功能獲得性改變，使腫 瘤細胞能夠規(guī)避體內(nèi)平衡期間的制約和平衡，從而驅(qū)動腫 瘤生長�；趀cDNA的擴增一直被認為是細胞增加特定基因拷貝數(shù)(CN)的一種方法，但它們的發(fā)生頻率尚不清楚。全基因組測序(WGS)數(shù)據(jù)的計算分析和新的環(huán)狀DNA文庫富集方法表明，在中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的腫 瘤中ecDNA的頻率相對較高。
研究人員應(yīng)用AmpliconArchitect基于 WGS腫 瘤組織的數(shù)據(jù)，與正常組織和血液ai癥基因組圖譜(TCGA) (n = 3731)比較，通過全基因組的泛ai分析(PCAWG)(n = 1291)量化并區(qū)分結(jié)構(gòu)區(qū)域大于10kb，超過4倍（CN > 4，樣本中位數(shù)以上倍數(shù)）的擴增子，這些擴增子分為(1)‘環(huán)狀’(圖1a)，表示存在于染色體外的擴增子；(2)‘BFB’，帶有由‘斷裂-融合-橋’(BFB)機制創(chuàng)建的標記；(3)‘重排列’，指含有來自不同染色體或染色體上相距很遠的DNA片段的非環(huán)狀擴增子(>1 Mb)；(4)‘線性’，表示線性擴增。擴增子狀態(tài)是腫 瘤標本分類的依據(jù)。缺乏擴增的樣本標記為“未檢測到局部體細胞CN擴增”（圖1a）。
測序結(jié)果表明，AmpliconArchitect在區(qū)分環(huán)狀DNA擴增子和線性DNA擴增子方面，WGS和環(huán)狀DNA測序（Circle-Seq）方法具有非常高的一致性（圖1b），表明分類的可靠性�；贏mpliconArchitect分類WGS中的 3212個腫 瘤樣本數(shù)據(jù)集和1810個非腫 瘤數(shù)據(jù)集，研究人員從中發(fā)現(xiàn)460例(14.3%)腫 瘤樣本進行1或多個環(huán)狀擴增子，證明在ai癥中ecDNA擴增是一種常見的事件。相比之下，環(huán)狀擴增在匹配的全血或正常組織樣本中幾乎檢測不到(圖1c)。環(huán)狀擴增子頻率的分布與早期ai癥模型的結(jié)果一致，表明ecDNA擴增是多種ai癥亞型的明確特征，而非正常細胞。
579個環(huán)狀擴增子的染色體分布與非環(huán)狀擴增子的染色體區(qū)域相比是非隨機的(圖2a)。在24個常復(fù)發(fā)的擴增ai基因中，有38%常出現(xiàn)在環(huán)狀擴增子上，其中PAX8占11%，CDK4占62%(圖2b)。在至少5個樣本擴增的1,804個ai基因列表中，21.8%的ai基因具有多個環(huán)狀結(jié)構(gòu)擴增。對于高度擴增的ai基因(即CN > 8)，這一比例進一步增加到53.5%。中樞 神經(jīng)系統(tǒng)中ai基因的環(huán)狀擴增比非環(huán)狀擴增更高。通過進一步觀察，ecDNA結(jié)構(gòu)和ai基因擴增之間的關(guān)聯(lián)并未延伸到斷點。對于24個頻繁擴增的ai基因，在單位間隔內(nèi)觀察特定數(shù)目斷點的頻率呈指數(shù)衰減，這與在ai基因周圍的大多數(shù)隨機發(fā)生保持一致(圖2c)。這些結(jié)果表明，ecDNA是通過隨機過程形成的，對促生長ai基因高拷貝的選擇導致ai基因在腫 瘤發(fā)育過程中快速擴增，而由于其遺傳不均一，保留了瘤內(nèi)的遺傳異質(zhì)性。
環(huán)狀ecDNA擴增的轉(zhuǎn)錄結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有擴增子類別中觀察到DNA CN和ai基因表達水平高度明顯相關(guān)(圖3a)。然而，DNA CN歸一化后，環(huán)狀擴增子上的ai基因表達明顯高于非環(huán)狀擴增子。轉(zhuǎn)錄活性中不依賴于CN的增加現(xiàn)象可能部分是因為增強子劫持機制和ecDNA上染色質(zhì)可及性提高。為了比較環(huán)狀擴增和非環(huán)狀區(qū)域之間控制基因表達的表觀遺傳機制，采用36個樣本(ATAC-seq)圖譜分析了轉(zhuǎn)座酶可達染色質(zhì)的重疊分析。經(jīng)DNA CN水平校正后，環(huán)狀和BFB擴增子的染色質(zhì)明顯比重排列和線性擴增子更容易接近(圖3b)，因此，增加的染色質(zhì)可及性在ecDNAai基因的失調(diào)中扮演了一個重要的角色。與非環(huán)狀擴增相比，環(huán)狀擴增的轉(zhuǎn)錄子融合頻率增加了5倍(圖3c)。我們觀察到圍繞環(huán)狀擴增子結(jié)構(gòu)的DNA CN，RNA表達和染色質(zhì)可及性的聚集(圖3d)。
通過臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與非環(huán)狀或無擴增的腫 瘤相比，含有ecDNA擴增的腫 瘤患者的5年生存率明顯更差(Fig. 4a)，并且環(huán)狀擴增子在惡性腫 瘤如膠質(zhì)母細胞瘤中更為普遍。文章通過擬合了Cox比例風險模型說明與疾病亞型相關(guān)的生存率，該模型在控制了疾病亞型后測試生存率。模型顯示，攜帶圓形擴增子的腫 瘤患者的危險比明顯更高(圖4b)。這些發(fā)現(xiàn)暗示染色體外DNA擴增與惡性腫 瘤的侵襲性行為有關(guān)，可能是通過為腫 瘤提供額外的途徑來繞過治 療和其他進化瓶頸。
總結(jié)
eccDNA測序（別名：Circle-Seq﹑環(huán)狀DNA測序）是eccDNA檢測利器，可以高通量地對各種物種樣本當中檢測樣品中的所有eccDNA，具有檢出率高﹑準確性好等優(yōu)點。云序生物eccDNA測序采用多種方法高效地富集和擴增eccDNA，簡述如下：首先，利用離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA，然后利用核酸酶進一步對富集的eccDNA進行消化除去殘余線性DNA。富集純化后，通過滾環(huán)擴增獲得大量的eccDNA拷貝，再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環(huán)狀DNA分子。嚴謹?shù)膶嶒灹鞒�，極大地提高了eccDNA的檢出率和檢測靈敏度。通過嚴謹?shù)膃ccDNA生信流程，實現(xiàn)了對eccDNA準確的識別和詳細的基因注釋，快速找到ai癥、腫 瘤等疾病機理研究和診斷的靶向eccDNA。
研究發(fā)現(xiàn)，許多擴增的原ai基因，并不只是位于染色體，而且還能變成游離的染色體外DNA（ecDNA），并出現(xiàn)大量拷貝，而且相當高比例的ecDNA是以環(huán)狀DNA分子的形式存在，即eccDNA（染色體外環(huán)狀DNA）。由于ecDNA不存在著絲粒，所以在細胞有絲分裂時，無法被均等地分配到兩個母細胞中，這就導致ecDNA的拷貝數(shù)會隨著細胞代數(shù)的增加而呈現(xiàn)巨大的異質(zhì)性，從而驅(qū)動腫 瘤演化過程，但是關(guān)于ecDNA發(fā)生頻率和臨床影響尚不清楚。
2020年8月17日發(fā)表在Nature genetic（IF=27.603）上的一篇題為《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》的文章揭示了ecDNA與致ai基因擴增及多種ai癥的不良預(yù)后間的相關(guān)性。通過對3212名ai癥患者的全基因組測序數(shù)據(jù)的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ecDNA擴增通常發(fā)生在大多數(shù)ai癥類型中；與線性DNA相比，ecDNA擴增而引起的ai基因轉(zhuǎn)錄水平更高，同時染色質(zhì)的可及性得到增強，能夠更頻繁地與轉(zhuǎn)錄本融合；攜帶ecDNA的ai癥患者的生存期也明顯短于非ecDNAai基因擴增引起的ai癥患者。此次研究結(jié)果表明，基于ecDNA的ai基因擴增在ai癥中普遍存在，并導致許多ai癥類型的患者預(yù)后不良。
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603實驗方法：Circle-Seq，全基因組測序，ATAC-seq
文章鏈接：《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》
研究內(nèi)容
1.eccDNA擴增廣 泛存在于各類ai癥類型中
ai基因擴增是ai細胞中常見的功能獲得性改變，使腫 瘤細胞能夠規(guī)避體內(nèi)平衡期間的制約和平衡，從而驅(qū)動腫 瘤生長�；趀cDNA的擴增一直被認為是細胞增加特定基因拷貝數(shù)(CN)的一種方法，但它們的發(fā)生頻率尚不清楚。全基因組測序(WGS)數(shù)據(jù)的計算分析和新的環(huán)狀DNA文庫富集方法表明，在中樞 神經(jīng)系統(tǒng)的腫 瘤中ecDNA的頻率相對較高。
研究人員應(yīng)用AmpliconArchitect基于 WGS腫 瘤組織的數(shù)據(jù)，與正常組織和血液ai癥基因組圖譜(TCGA) (n = 3731)比較，通過全基因組的泛ai分析(PCAWG)(n = 1291)量化并區(qū)分結(jié)構(gòu)區(qū)域大于10kb，超過4倍（CN > 4，樣本中位數(shù)以上倍數(shù)）的擴增子，這些擴增子分為(1)‘環(huán)狀’(圖1a)，表示存在于染色體外的擴增子；(2)‘BFB’，帶有由‘斷裂-融合-橋’(BFB)機制創(chuàng)建的標記；(3)‘重排列’，指含有來自不同染色體或染色體上相距很遠的DNA片段的非環(huán)狀擴增子(>1 Mb)；(4)‘線性’，表示線性擴增。擴增子狀態(tài)是腫 瘤標本分類的依據(jù)。缺乏擴增的樣本標記為“未檢測到局部體細胞CN擴增”（圖1a）。
測序結(jié)果表明，AmpliconArchitect在區(qū)分環(huán)狀DNA擴增子和線性DNA擴增子方面，WGS和環(huán)狀DNA測序（Circle-Seq）方法具有非常高的一致性（圖1b），表明分類的可靠性�；贏mpliconArchitect分類WGS中的 3212個腫 瘤樣本數(shù)據(jù)集和1810個非腫 瘤數(shù)據(jù)集，研究人員從中發(fā)現(xiàn)460例(14.3%)腫 瘤樣本進行1或多個環(huán)狀擴增子，證明在ai癥中ecDNA擴增是一種常見的事件。相比之下，環(huán)狀擴增在匹配的全血或正常組織樣本中幾乎檢測不到(圖1c)。環(huán)狀擴增子頻率的分布與早期ai癥模型的結(jié)果一致，表明ecDNA擴增是多種ai癥亞型的明確特征，而非正常細胞。
圖 1 腫 瘤與非腫 瘤組織的環(huán)型擴增子發(fā)生頻率
2.復(fù)發(fā)性ai基因擴增往往發(fā)生在ecDNA上579個環(huán)狀擴增子的染色體分布與非環(huán)狀擴增子的染色體區(qū)域相比是非隨機的(圖2a)。在24個常復(fù)發(fā)的擴增ai基因中，有38%常出現(xiàn)在環(huán)狀擴增子上，其中PAX8占11%，CDK4占62%(圖2b)。在至少5個樣本擴增的1,804個ai基因列表中，21.8%的ai基因具有多個環(huán)狀結(jié)構(gòu)擴增。對于高度擴增的ai基因(即CN > 8)，這一比例進一步增加到53.5%。中樞 神經(jīng)系統(tǒng)中ai基因的環(huán)狀擴增比非環(huán)狀擴增更高。通過進一步觀察，ecDNA結(jié)構(gòu)和ai基因擴增之間的關(guān)聯(lián)并未延伸到斷點。對于24個頻繁擴增的ai基因，在單位間隔內(nèi)觀察特定數(shù)目斷點的頻率呈指數(shù)衰減，這與在ai基因周圍的大多數(shù)隨機發(fā)生保持一致(圖2c)。這些結(jié)果表明，ecDNA是通過隨機過程形成的，對促生長ai基因高拷貝的選擇導致ai基因在腫 瘤發(fā)育過程中快速擴增，而由于其遺傳不均一，保留了瘤內(nèi)的遺傳異質(zhì)性。
圖 2 環(huán)型擴增子的ai基因含量和結(jié)構(gòu)成分
3.與線性DNA相比，ecDNA擴增導致的ai基因轉(zhuǎn)錄水平更高環(huán)狀ecDNA擴增的轉(zhuǎn)錄結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所有擴增子類別中觀察到DNA CN和ai基因表達水平高度明顯相關(guān)(圖3a)。然而，DNA CN歸一化后，環(huán)狀擴增子上的ai基因表達明顯高于非環(huán)狀擴增子。轉(zhuǎn)錄活性中不依賴于CN的增加現(xiàn)象可能部分是因為增強子劫持機制和ecDNA上染色質(zhì)可及性提高。為了比較環(huán)狀擴增和非環(huán)狀區(qū)域之間控制基因表達的表觀遺傳機制，采用36個樣本(ATAC-seq)圖譜分析了轉(zhuǎn)座酶可達染色質(zhì)的重疊分析。經(jīng)DNA CN水平校正后，環(huán)狀和BFB擴增子的染色質(zhì)明顯比重排列和線性擴增子更容易接近(圖3b)，因此，增加的染色質(zhì)可及性在ecDNAai基因的失調(diào)中扮演了一個重要的角色。與非環(huán)狀擴增相比，環(huán)狀擴增的轉(zhuǎn)錄子融合頻率增加了5倍(圖3c)。我們觀察到圍繞環(huán)狀擴增子結(jié)構(gòu)的DNA CN，RNA表達和染色質(zhì)可及性的聚集(圖3d)。
圖 3 不同類型擴增子的基因表達和染色質(zhì)可及性
4.攜帶ecDNA的ai癥患者生存期更短通過臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與非環(huán)狀或無擴增的腫 瘤相比，含有ecDNA擴增的腫 瘤患者的5年生存率明顯更差(Fig. 4a)，并且環(huán)狀擴增子在惡性腫 瘤如膠質(zhì)母細胞瘤中更為普遍。文章通過擬合了Cox比例風險模型說明與疾病亞型相關(guān)的生存率，該模型在控制了疾病亞型后測試生存率。模型顯示，攜帶圓形擴增子的腫 瘤患者的危險比明顯更高(圖4b)。這些發(fā)現(xiàn)暗示染色體外DNA擴增與惡性腫 瘤的侵襲性行為有關(guān)，可能是通過為腫 瘤提供額外的途徑來繞過治 療和其他進化瓶頸。
圖 4 環(huán)型擴增子與不良預(yù)后相關(guān)
總結(jié)
本文作者通過提供的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀ecDNA在ai癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，環(huán)狀ecDNA為實現(xiàn)和維持高拷貝ai基因擴增和多樣性，同時驅(qū)動染色質(zhì)可達性增強和ai基因轉(zhuǎn)錄升高。這種擴增機制在很大一部分人類ai癥中起作用，并對患者預(yù)后產(chǎn)生負面影響，與ai癥譜系無關(guān)。結(jié)果展示了ecDNA在ai癥中的應(yīng)用�？紤]到ai癥的異質(zhì)性，可以肯定不同類型的ai癥之間存在ecDNA結(jié)構(gòu)和行為的多樣性。進一步的研究將有助于更好地理解產(chǎn)生包括ecDNA在內(nèi)的基因組重排的機制，如深入研究跨ai癥的復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的模式。本文在ai癥基因組學和廣 泛的患者群體實用性之間建立聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)人類ai癥中ecDNA進行診斷或治 療的潛力。
eccDNA測序（別名：Circle-Seq﹑環(huán)狀DNA測序）是eccDNA檢測利器，可以高通量地對各種物種樣本當中檢測樣品中的所有eccDNA，具有檢出率高﹑準確性好等優(yōu)點。云序生物eccDNA測序采用多種方法高效地富集和擴增eccDNA，簡述如下：首先，利用離子交換柱高效富集基因組DNA中的eccDNA，然后利用核酸酶進一步對富集的eccDNA進行消化除去殘余線性DNA。富集純化后，通過滾環(huán)擴增獲得大量的eccDNA拷貝，再利用NGS測序高通量地檢測樣品中所有的環(huán)狀DNA分子。嚴謹?shù)膶嶒灹鞒�，極大地提高了eccDNA的檢出率和檢測靈敏度。通過嚴謹?shù)膃ccDNA生信流程，實現(xiàn)了對eccDNA準確的識別和詳細的基因注釋，快速找到ai癥、腫 瘤等疾病機理研究和診斷的靶向eccDNA。
云序生物eccDNA測序?qū)嶒炇疽鈭D
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