動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis）是心血管系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一，對(duì)人類健康有嚴(yán)重危害。內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)作為動(dòng)脈粥樣硬化的第一步，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加、屏障功能受損以及粘附分子的表達(dá)，促使單核細(xì)胞遷移并粘附于血管內(nèi)皮表面，進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

 

N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾是真核生物中最常見(jiàn)且最豐富的RNA修飾。近期的研究表明，m6A修飾在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括發(fā)育、代謝和繁殖。至于m6A在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮什么作用，目前的研究還很有限，其潛在機(jī)制有待闡明。

 

為此，河南省人民醫(yī)院李牧蔚團(tuán)隊(duì)等機(jī)構(gòu)的研究人員深入研究了m6A修飾在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制及其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的影響。他們發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14通過(guò)增強(qiáng)m6A修飾而促進(jìn)FOXO1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。

 

這項(xiàng)成果于近日發(fā)表在《Theranostics》雜志上。它首次證明了m6A修飾在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用，顯示METTL14可作為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。

 

 

METTL14修飾了FOXO1的mRNA

在這項(xiàng)研究中，研究人員首先構(gòu)建了TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型，并評(píng)估了m6A修飾相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以確定參與此過(guò)程的主要因素。qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中顯著上調(diào)（圖1）。同樣地，METTL14在動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)也顯著上調(diào)。

 

圖1. METTL14在TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)

 

接著他們發(fā)現(xiàn)，在TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中，聚腺苷酸化RNA的m6A/A的比例增加，而METTL14的敲低抑制了這個(gè)比例的增加。此外，TNF-α處理和METTL14過(guò)表達(dá)可提高粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)水平。有意思的是，METTL14可以獨(dú)立于m6A修飾機(jī)制來(lái)促進(jìn)VCAM-1和ICAM-1表達(dá)。

 

那么，METTL14通過(guò)何種機(jī)制來(lái)調(diào)控VCAM-1和ICAM-1介導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附？為了確定背后的機(jī)制，研究人員通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）來(lái)鑒定m6A修飾的mRNA。他們將注意力集中在轉(zhuǎn)錄因子FOXO1上，因?yàn)橄惹暗难芯勘砻鱂OXO1可通過(guò)直接結(jié)合VCAM-1和ICAM-1的啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。

 

圖2. METTL14修飾FOXO1 mRNA

 

如圖2所示，TNF-α刺激增加了METTL14與FOXO1 mRNA之間的關(guān)聯(lián)，并促進(jìn)了FOXO1 mRNA的m6A修飾。METTL14的敲低則部分減弱了TNF-α誘導(dǎo)的FOXO1表達(dá)。這些結(jié)果表明，METTL14介導(dǎo)的FOXO1 m6A修飾促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞中FOXO1表達(dá)上調(diào)。

 

YTHDF1通過(guò)識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)來(lái)促進(jìn)FOXO1翻譯

m6A修飾通常通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性或促進(jìn)其翻譯來(lái)調(diào)控蛋白表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激和METTL14敲低對(duì)FOXO1 mRNA的穩(wěn)定性沒(méi)有明顯影響，故推測(cè)調(diào)控作用取決于翻譯。RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，m6A閱讀器蛋白YTHDF1可直接與FOXO1 mRNA結(jié)合。

 

通過(guò)多核糖體分離分析，他們證實(shí)了TNF-α刺激顯著增強(qiáng)了FOXO1 mRNA的翻譯能力，并且在敲低YTHDF1后，這種作用被顯著抑制。RIP分析結(jié)果表明3′-UTR區(qū)域是真正的m6A修飾位點(diǎn)。這一區(qū)域若發(fā)生突變，則TNF-α刺激不會(huì)促進(jìn)m6A修飾，也不會(huì)增強(qiáng)YTHDF1的結(jié)合。這些結(jié)果表明，METTL14直接與FOXO1 mRNA結(jié)合并增加其m6A修飾，通過(guò)YTHDF1的識(shí)別來(lái)促進(jìn)FOXO1翻譯。

 

METTL14與FOXO1合作促進(jìn)粘附因子的轉(zhuǎn)錄

盡管METTL14發(fā)揮酶促作用增強(qiáng)m6A修飾，但它是否促進(jìn)VCAM-1和ICAM-1的轉(zhuǎn)錄呢？研究人員從HUVEC細(xì)胞中沉淀了內(nèi)源性METTL14蛋白復(fù)合物，并開(kāi)展質(zhì)譜分析。結(jié)果表明，METTL14還與FOXO1形成復(fù)合物。通過(guò)后續(xù)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，他們進(jìn)一步證實(shí)，TNF-α處理可誘導(dǎo)FOXO1- METTL14復(fù)合物與VCAM-1和ICAM-1啟動(dòng)子結(jié)合，激活這些粘附因子的轉(zhuǎn)錄，從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

 

圖3. METTL14與FOXO1一起促進(jìn)粘附因子的轉(zhuǎn)錄

 

METTL14表達(dá)的降低明顯抑制動(dòng)脈粥樣硬化

為了進(jìn)一步研究METTL14對(duì)體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，他們委托賽業(yè)生物構(gòu)建了雜合的METTL14基因敲除小鼠（因?yàn)镸ETTL14基因敲除可導(dǎo)致小鼠在胚胎期死亡）。與對(duì)照小鼠相比，METTL14基因敲除顯著降低了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)，METTL14通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠FOXO1的表達(dá)來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

 

這項(xiàng)研究從表觀遺傳學(xué)的角度探索了內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的調(diào)控機(jī)制。“我們的結(jié)果證實(shí)了METTL14可通過(guò)對(duì)FOXO1的m6A修飾來(lái)增強(qiáng)其翻譯，從而增強(qiáng)粘附分子的表達(dá)，并介導(dǎo)內(nèi)皮-單核細(xì)胞粘附，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。另一方面，METTL14還與FOXO1發(fā)生相互作用，增強(qiáng)FOXO1介導(dǎo)的粘附分子轉(zhuǎn)錄，”作者在文中寫(xiě)道。

 

圖4. METTL14介導(dǎo)的m6A修飾影響動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制

 

他們指出，這是首次研究m6A修飾在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。這項(xiàng)研究證明了METTL14在體內(nèi)和體外對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的作用，有望為動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供新思路。

 

原文檢索：

Jian D, Wang Y, Jian L, Tang H, Rao L, Chen K, Jia Z, Zhang W, Liu Y, Chen X, Shen X, Gao C, Wang S, Li M. METTL14 aggravates endothelial inflammation and atherosclerosis by increasing FOXO1 N6-methyladeosine modifications. Theranostics 2020; 10(20):8939-8956. doi:10.7150/thno.45178.