鑒于COVID-2019造成的全球醫(yī)療緊急情況，加快創(chuàng)新步伐和開發(fā)工具來應(yīng)對COVID-19的傳播至關(guān)重要�？茖W(xué)界正在發(fā)揮其最大的創(chuàng)造力，以識別和推進(jìn)預(yù)防，檢測和治療的解決方案。BioXp™3200系統(tǒng)是使全球研究人員能夠快速合成SARS-CoV-2基因組部分的理想平臺，使它們易于用于開發(fā)疫苗，診斷和治療方法。

介紹

SARS-CoV-2是傳染病COVID-19的致病因子，COVID-19已經(jīng)被認(rèn)為是全球大流行疾病。SARS-CoV-2感染了成千上萬的人，奪走了全世界成千上萬人的生命^[1]。SARS-CoV-2也與2002-2003年導(dǎo)致SARS大流行的病毒密切相關(guān)，共有約80％的基因組的相似性^[2]。該病毒的主要傳播途徑是通過感染者產(chǎn)生的呼吸道飛沫傳播。密切接觸（<〜6英尺）會增加人與人之間傳播的機(jī)會（導(dǎo)致在社區(qū)內(nèi)可以迅速傳播），從而使該病毒具有高度傳染性。預(yù)期世界衛(wèi)生組織（WHO）已宣布COVID-2019爆發(fā)為全球性公共衛(wèi)生突發(fā)事件，并將其確認(rèn)為全球大流行^[3]。

SARS-CoV-2，類似于SARS和MERS爆發(fā)的致病因子，是長度約為30kb的單鏈正鏈RNA基因組，是RNA病毒中最多的病毒之一。冠狀病毒是一類由外套膜包裹的正鏈ＲNA 病毒，具有螺旋對稱的衣殼和外套膜結(jié)構(gòu)。冠狀病毒基因組為線性單股正鏈ＲNA，5' 端為甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，3' 端具有 poly( A) 尾巴，長度在 27 ～ 32 kb之間，是目前已知的 ＲNA 病毒中最長的 ＲNA 鏈^[4-5]。SARS-CoV-2 的RNA基因組( 如圖 1 所示) 全長在 26000～32000 個堿基之間，Roujian Lu 等人根據(jù)從病人樣本分離得到的 6 組病毒基因組分析預(yù)測SARS-CoV-2至少有 12 個編碼區(qū)，包括非結(jié)構(gòu)蛋白開放閱讀框( open reading frame，OＲF) 1ab、3、7、8、9、10b、13、14 和 4 個結(jié)構(gòu)蛋白刺突( S) 蛋白、膜( M) 蛋白、包膜( E) 蛋白、核衣殼( N) 蛋白^[6]。

 

SARS-CoV-2冠狀病毒顆粒 (如圖2所示) 是由一個正鏈的 ＲNA 基因組和 4 個結(jié)構(gòu)蛋白 S、E、M 和 N 組成。磷酸化 N 蛋白組成病毒核衣殼，該蛋白被埋在磷脂雙層中,并被S覆蓋。M蛋白和E蛋白位于病毒包膜的S蛋白之間，構(gòu)成了病毒體。

根據(jù)基因序列分析，SARS-CoV-2在遺傳學(xué)上與 SARS-CoV 和MERS-CoV的同源性分別為 79%和 50% ^[6]。對比SARS-CoV 和MERS-CoV 序 列，SARS-CoV-2 在非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域 ORF3、ORF6、7 和 8，以及結(jié)構(gòu)蛋白E、N，特別是 S 蛋白的差異^[7]，導(dǎo)致SARS-CoV-2在病毒靶向宿主和免疫反應(yīng)能力上的改變，進(jìn)而影響了SARS-CoV-2的毒力和傳播能力，提示對于 COVID-19臨床用藥、疫苗開發(fā)以及疾病防控策略，應(yīng)在兩種冠狀病毒病的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整^[8]。

 

到目前為止，尚無疫苗或治療藥物可抗擊SARS-CoV-2。生物學(xué)，特別是DNA書寫技術(shù)，可以快速研發(fā)預(yù)防劑（疫苗）和治療劑（單克隆抗體）。此外，DNA書寫可以生成用于診斷試劑盒和測定開發(fā)的質(zhì)量有保證的材料。

經(jīng)過合理重新設(shè)計的全長減毒基因組有助于開發(fā)針對該病毒的疫苗。另外，病毒基因組部分有助于產(chǎn)生抗原的抗病毒抗體，從而可以開發(fā)出可以有效治療感染患者的治療方案選擇。研發(fā)疫苗，診斷劑和治療劑的開發(fā)對于阻止這種感染的傳播是必不可少的。

在本應(yīng)用筆記中，我們描述了SARS-CoV-2整個基因組的按需生產(chǎn)�；�因組部分是使用BioXp™3200系統(tǒng)設(shè)計合成的。我們還描述了這些部分的連接以裝配SARS-CoV-2的全長基因組作為大腸桿菌中的細(xì)菌性人工染色體（BAC）。鑒于到目前為止已經(jīng)確定了SARS-CoV-2的基因組變異體的數(shù)量（https://nextstrain.org/ncov），可能有必要將其迅速納入疫苗，治療和診斷開發(fā)流程。3200系統(tǒng)通過在儀器的單個通宵運(yùn)行中快速合成多達(dá)32個獨(dú)立的變異基因組部分，從而加速了這一流程。
 

方案

在BioXp™3200系統(tǒng)上設(shè)計和合成SARS-CoV-2基因組部分Codex的專有設(shè)計軟件使用重復(fù)，GC流量，GC含量等參數(shù)計算序列復(fù)雜性，并合理設(shè)計了SARS-CoV-2基因組的分階段構(gòu)建（約30kb）。該工具能夠手動添加添加獨(dú)特的GibsonAssembly^®限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)之后的序列（30bp）。在組裝的所有三個階段中這些特征允SARS-CoV-2基因組片段的擴(kuò)增和克�。▓D3）。設(shè)計完成后，我們下了訂單，在三個工作日內(nèi)收到了寡核苷酸板和專有試劑。


 

圖3：SARS-CoV-2基因組的分層裝配方案。 

使用三個組裝階段合成基因組：在BioXp™3200系統(tǒng)上完成24 X〜1.4 kb的第一階段組裝，然后將6 X〜5.3 kb組裝成第二階段分子和〜30 kb第三階段基因組。

  我們將寡核苷酸板和試劑加載到BioXp™3200系統(tǒng)上，并啟動了自動生成的程序。BioXp™運(yùn)行始于每個片段的初始構(gòu)建，然后進(jìn)行錯誤校正，I級分子的擴(kuò)增和DNA片段的純化。BioXp™3200系統(tǒng)成功生成了構(gòu)成整個SARS-CoV-2基因組的所有24個片段（圖4）。

           圖4：使用BioXp™3200系統(tǒng)組裝SARS-CoV-2基因組。

（A）在BioXp™系統(tǒng)上合成的24Xstage I分子然后組裝成Stage II和Stage III分子。

（B）使用限制性核酸內(nèi)切酶處理從BAC釋放〜30kb SARS-CoV-2基因組后，使用FIGE分析分析攜帶III期分子的克隆。

（C）沿著側(cè)分子量標(biāo)準(zhǔn)克隆到BAC中的完整基因組的超螺旋DNA分析（顯示了來自單個代表性克隆的DNA分析）。

全長SARS-CoV-2基因組的層次組裝

使用GibsonAssembly^®HiFi套件（Codex目錄 no. GA1100），我們克隆了第I階段的分子（〜1.4 kb），并使用Sanger測序（GENEWIZ）對其進(jìn)行了測序。我們使用GibsonAssembly^®HiFi試劑盒將三個連續(xù)的，將第I階段分子組裝成第二II階段分子，并通過PCR擴(kuò)增了產(chǎn)物，然后按尺寸選擇產(chǎn)品。使用GibsonAssembly®Ultrakit（Codex no.GA1200）將這些II階段分子進(jìn)一步組裝成SARS-CoV-2的全長基因組，并使用BAC進(jìn)行克隆。通過菌落PCR和場轉(zhuǎn)化凝膠電泳（FIGE），我們驗(yàn)證了克隆在BAC中的整個基因組的存在。通過在適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)準(zhǔn)下，在無溴乙錠的1％瓊脂糖凝膠上4.5V/cm電泳180分鐘，通過電泳分離超螺旋DNA，進(jìn)一步可視化整個克隆的基因組。

結(jié)論

BioXp™3200系統(tǒng)和工具使我們能夠構(gòu)建SARS-CoV-2的整個基因組，從設(shè)計到最終組裝。

 使用Codex專有的設(shè)計工具創(chuàng)建了構(gòu)建SARS-CoV-2基因組所必需的三級程序集的計算機(jī)硅制圖。具體來說，我們將SARS-CoV-2的整個〜30 kb基因組分為了第一階段分子（24 X〜1.4 kb）二十四個部分。我們通過BioXp™套件訂購門戶訂購了具有獨(dú)特末端的這些零件。交付后，我們將試劑加載到BioXp™系統(tǒng)上并執(zhí)行運(yùn)行。經(jīng)過16小時的運(yùn)行，成功生成了包含SARS-CoV-2基因組的所有24dsDNA片段。我們使用GibsonAssembly^®方法克隆了片段，并使用Sanger測序分離了無錯誤的克隆。

通過GibsonAssembly^®方法將三個連續(xù)的I期克隆合并為II期分子（〜5.3 kb），然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和大小選擇。我們使用GibsonAssembly^®方法將由此獲得的六個II期分子組裝成BAC。接下來，我們使用菌落PCR篩選了96個菌落，并驗(yàn)證了III期組裝基因組中II期分子的存在。然后，我們通過菌落PCR選擇了24個陽性鑒定的克隆。我們從中提取了SARS-CoV-2BAC，并使用限制酶消化從BAC中釋放了基因組。使用FIGE分析釋放的片段。我們測試的所有24個菌落均帶有〜30 kb插入片段，表明SARS-CoV-2基因組的存在。我們對其中的幾個菌落進(jìn)行了超級螺旋DNA分析，從而可以可視化以環(huán)形分子形式克隆到BAC中的SARS-CoV-2基因組。所有測試的菌落均經(jīng)過驗(yàn)證以包含全長基因組（圖4）。

總結(jié)

以前，食品法典委員會的科學(xué)家開發(fā)并部署了合成DNA技術(shù)，以通過產(chǎn)生菌株特異性抗原部分來應(yīng)對流感的年度威脅^[9]。SARS-CoV-2基因組變體的新威脅將觸發(fā)合成生物學(xué)的類似用途，以合成抗原的多種菌株特異性變體，例如刺突蛋白。BioXp™3200系統(tǒng)和工具是一種破壞性技術(shù)，可加快發(fā)現(xiàn)疫苗，診斷方法和治療方法的速度。BioXp™3200系統(tǒng)具有高度精確的合成dsDNA分子的能力，并能夠?qū)崿F(xiàn)快速的設(shè)計和合成迭代循環(huán)，它將擴(kuò)展研究人員針對人類，牲畜和植物的其他傳染原的發(fā)現(xiàn)能力。

參考文獻(xiàn)

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