建立合適的疾病動(dòng)物模型是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研中非常重要的研究方法，大鼠和小鼠是疾病研究中的主力軍。由于體積小、成本低，特別是胚胎細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定，方便進(jìn)行各種遺傳操作，進(jìn)行基因編輯這個(gè)優(yōu)點(diǎn)，使得小鼠成為解析人類(lèi)基因功能最重要的模式生物。但是，與小鼠相比，大鼠在生理特征、形態(tài)和基因上更加接近人類(lèi)，同時(shí)大鼠較大的身體和器官尺寸便于多次采樣，以及進(jìn)行體內(nèi)電生理學(xué)、神經(jīng)外科和神經(jīng)影像學(xué)程序操作，因此，相對(duì)小鼠來(lái)說(shuō)，大鼠更合適用于毒理學(xué)、畸形學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、實(shí)驗(yàn)老年學(xué)、心血管、牙科和實(shí)驗(yàn)寄生蟲(chóng)學(xué)等領(lǐng)域的研究。接下來(lái)我們將重點(diǎn)探討大鼠與小鼠有哪些差異？這些差異使得在哪些研究領(lǐng)域更適合選擇大鼠？如何最大化地發(fā)揮大鼠的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行研究？

 

大鼠與小鼠主要有哪些差異？

首先是在與人類(lèi)的相似性方面，雖然大鼠小鼠和人類(lèi)進(jìn)化的差異區(qū)別很小。但大鼠某些方面與人類(lèi)更為接近，比如小鼠的心率可以達(dá)到600 bpm，而大鼠則降低到了300 bpm左右，與人類(lèi)的70 bpm更為接近。基因組上看，小鼠為26億對(duì)，大鼠27.5億對(duì)，與人類(lèi)的29億對(duì)更為接近。染色體方面，小鼠20對(duì)，大鼠和人類(lèi)分別是21和23對(duì)。

 

SD大鼠和C57小鼠是生物醫(yī)學(xué)研究中（尤其是神經(jīng)生物學(xué)研究）中最常用的大鼠和小鼠代表，最近的研究通過(guò)基于基因芯片分析發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)到的10,833個(gè)基因中，有4713個(gè)基因在大鼠和小鼠的海馬神經(jīng)元樹(shù)突中存在表達(dá)差異。而同樣也是采用基因芯片技術(shù)研究海馬神經(jīng)元，只有54個(gè)基因在C57BL/6和BALB/c兩個(gè)最常用的小鼠品系之間有差異表達(dá)。考慮到海馬體在行為(尤其是學(xué)習(xí)記憶)中的重要性，這一發(fā)現(xiàn)很好地解釋了大小鼠行為方面的不同。同樣地，研究人員還比較了大鼠和小鼠的其他組織(包括心臟、骨骼肌、腸子等)，盡管這些組織的差異也很大，但它們遠(yuǎn)沒(méi)有海馬體中的差異那么明顯。不過(guò)這也足夠提醒我們要注意大小鼠之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。大鼠和小鼠之間最明顯的區(qū)別之一是在大小和體重上，成年大鼠的體重大約是成年小鼠的8到10倍，體型方面對(duì)科研造成的影響則是有利有弊。

 

哪些研究領(lǐng)域更適合選擇大鼠？

1）大鼠是研究心血管疾病極好的模型，尤其是中風(fēng)和高血壓，而且有多種品系的大鼠模型已經(jīng)成為這些研究的理想對(duì)象。

2）大鼠乳腺癌模型優(yōu)于小鼠模型，因?yàn)樗鼈儗?duì)組織病理學(xué)有激素反應(yīng)，并且具有更接近人類(lèi)疾病的癌前階段。

3）大鼠是人類(lèi)生殖力學(xué)研究的主要模型。

4）在糖尿病模型中，大鼠模型在一些重要的方面與人類(lèi)更為接近，包括環(huán)境因素(如毒素、壓力、飲食和疫苗接種)改變疾病的能力。

5）經(jīng)退行性疾病方面，Pink1和DJ-1敲除的大鼠在8月齡時(shí)表現(xiàn)出中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元50%以上的丟失，相比于小鼠表型的不明顯，大鼠基因編輯模型給了我們更多治療帕金森病的希望。這也是第一次在基因編輯動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元的丟失。同時(shí)這些大鼠也在檢測(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了癥狀。

6）小鼠在行為學(xué)上的一致性比較差，通常需要每組數(shù)量在大鼠的1.5倍時(shí)統(tǒng)計(jì)所得的結(jié)果才相對(duì)可靠。大鼠比小鼠更聰明，在學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)中具有更好的表現(xiàn)，因此藥物對(duì)它們的影響也更為明顯。在疼痛研究方面，大鼠不容易出現(xiàn)小鼠中常見(jiàn)的焦慮引起的痛覺(jué)麻木，事實(shí)上，痛覺(jué)相關(guān)的文獻(xiàn)數(shù)量上大鼠從來(lái)沒(méi)有被小鼠打敗過(guò)。

7）過(guò)去的臨床前研究在小鼠實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了藥物的有效性之后，還需要在大鼠身上對(duì)安全性進(jìn)行驗(yàn)證，才能進(jìn)行臨床的人體安全性試驗(yàn)，這是因?yàn)榇笫蟮陌踩�性�?shù)據(jù)在歷史上積累豐富，參考性很強(qiáng)。在大鼠基因編輯成熟之后，人們便可以在大鼠身上直接和同時(shí)進(jìn)行有效性和安全性的檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間。

8）大鼠的大體型提供了許多實(shí)際的優(yōu)勢(shì)，特別是在外科手術(shù)和脊髓損傷的研究中，大鼠模型在這方面具有很大的轉(zhuǎn)化價(jià)值。同時(shí)在器官組織成像研究中也比小鼠更有優(yōu)勢(shì)。

 

近年來(lái)在醫(yī)療科研領(lǐng)域，從臨床前向臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，大量基于小鼠的研究以失敗而告終，這讓人們不得不靜下心來(lái)思考是否我們還是需要與這些人類(lèi)疾病更相關(guān)的動(dòng)物模型，在這個(gè)背景之下，科學(xué)家們又將目光重新投向了大鼠，因?yàn)楸绕痖_(kāi)發(fā)新的模式動(dòng)物所需投入的巨大時(shí)間和資金投入，大鼠算是人們的了“老朋友”了，而且大鼠在基因編輯時(shí)代的潛力還遠(yuǎn)未得到充分開(kāi)發(fā)。

 

如何最大化地發(fā)揮大鼠的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行研究？

隨著人們對(duì)大鼠胚胎控制能力的增強(qiáng)以及CRISPR/Cas9技術(shù)的到來(lái)，拓展了大鼠做為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物在基礎(chǔ)研究及藥物篩選、臨床前藥物評(píng)價(jià)的應(yīng)用范圍。但是，作為最重要的基因條件性表達(dá)方案，Cre-LoxP系統(tǒng)中大鼠品種相對(duì)小鼠種類(lèi)上要少了很多，這一點(diǎn)嚴(yán)重阻礙了我們對(duì)大鼠的應(yīng)用。Cre-LoxP系統(tǒng)在小鼠中的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)廣泛了，很多基因都有對(duì)應(yīng)的LoxP小鼠存在，同時(shí)特異性啟動(dòng)子的Cre小鼠資源也相當(dāng)豐富。但是在大鼠中，由于基因編輯技術(shù)發(fā)展的落后，目前無(wú)論是LoxP大鼠還是連接了組織特異性啟動(dòng)子的Cre大鼠，它們的種類(lèi)都要遠(yuǎn)低于小鼠。賽業(yè)生物針對(duì)超排大鼠胚胎受精比例低而畸形胚胎比例高，卵細(xì)胞品系和個(gè)體間差異大，核膜和質(zhì)膜更厚更有彈性導(dǎo)致更難注射等多項(xiàng)難點(diǎn)，不斷優(yōu)化生產(chǎn)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)，攻克多項(xiàng)技術(shù)難關(guān)，可實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的條件性基因敲除大鼠模型創(chuàng)建。賽業(yè)生物可為您提供基因敲除、點(diǎn)突變、基因敲入等多種基因編輯大鼠服務(wù)，還可為您提供SD、Wistar、Long Evans、F344、Brown Norway大鼠等多種品系選擇，致力于為您構(gòu)建更好的大鼠模型。賽業(yè)生物正在著手建立一個(gè)Cre模型庫(kù)，其中包含各種大小鼠品系，以供全球研究人員使用。

 

 備注：除以上列出的Cre大鼠模型外，如您需要其他品系的大鼠模型，可撥打400-680-8038聯(lián)系我們，以獲取專(zhuān)屬的定制服務(wù)報(bào)價(jià)。

考慮到Cre大鼠需要與LoxP大鼠雜交一至兩代才能得到條件性基因編輯動(dòng)物，同時(shí)Cre酶也存在效率和一定概率的泄露問(wèn)題，可能會(huì)對(duì)科研進(jìn)度產(chǎn)生影響，病毒誘導(dǎo)的大鼠基因過(guò)表達(dá)/敲除/敲入/點(diǎn)突變便應(yīng)運(yùn)而生。

 

目前主要使用的病毒表達(dá)系統(tǒng)有三種，即腺病毒（Adeno）、慢病毒和腺相關(guān)病毒表達(dá)系統(tǒng)，這些病毒系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)：

1）腺病毒的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)效率高，表達(dá)起始時(shí)間早，可包裝DNA片段相對(duì)最大，但有很強(qiáng)的免疫原性和毒性，一般適用于離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用在活體上的話(huà)動(dòng)物死亡率高，實(shí)驗(yàn)窗口期短。

 

2）慢病毒則可以逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并永久整合到宿主基因中，因此目的基因可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，慢病毒是最常用的基因傳遞病毒系統(tǒng)，并且具有比腺病毒小得多的免疫原性。雖然也可以用作活體轉(zhuǎn)染，但是在滴度，效率和免疫原性都更好的腺相關(guān)病毒面有些“相形見(jiàn)絀”。

 

3）腺相關(guān)病毒的最大優(yōu)勢(shì)在于極低的免疫原性可以在最大可能地保證自己能與宿主長(zhǎng)期共存。生物安全性也很高，可以在生物安全等級(jí)較低的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，種類(lèi)繁多的血清型使得其對(duì)不同組織的親和度有區(qū)別，使得即便在全身注射的情況下仍然具有很強(qiáng)的組織特異性，輔以定位注射的話(huà)，可以大大提高實(shí)驗(yàn)的組織細(xì)胞精度，是最適合活體實(shí)驗(yàn)的工具病毒，但也存在克隆容量不足的問(wèn)題。

 

圖1. 三種常見(jiàn)病毒載體比較

 

綜合三種工具病毒的優(yōu)缺點(diǎn)來(lái)看，在與Cre或者LoxP動(dòng)物聯(lián)用方面，AAV介導(dǎo)的組織特異性表達(dá)具有相對(duì)于另外兩種病毒系統(tǒng)更好的效果。

 

圖2.不同AAV的組織特異性

 

正因?yàn)锳AV的這些優(yōu)點(diǎn)，得以使其在與Cre或者LoxP大鼠鼠的配合中大放異彩。這是因?yàn)殡m然人們正在開(kāi)發(fā)更多的LoxP和Cre大鼠，但這個(gè)過(guò)程并非一蹴而就。考慮到大鼠中Cre酶的效率和有可能存在的泄露問(wèn)題，可能導(dǎo)致開(kāi)發(fā)時(shí)間會(huì)變得更長(zhǎng)。因此，目前最佳策略是在開(kāi)發(fā)Cre和LoxP大鼠的同時(shí)，利用AAV病毒先行對(duì)已有大鼠進(jìn)行組織特異性操作。病毒載體的構(gòu)建總是要比動(dòng)物繁殖到可用于實(shí)驗(yàn)的數(shù)量所需時(shí)間要少得多。因此可以通過(guò)這種方法盡快對(duì)動(dòng)物的表型進(jìn)行研究和驗(yàn)證，盡早決定下一步的研究策略和方向，節(jié)省科研人員寶貴的時(shí)間。

 

需要注意的是，AAV注射所產(chǎn)生的特異性表達(dá)并非僅僅只是節(jié)省時(shí)間的“權(quán)宜之計(jì)”。由于生命科學(xué)研究中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的不確定性，以及目前開(kāi)發(fā)出來(lái)的越來(lái)越豐富的研究手段，要想研究結(jié)果得到認(rèn)同，多種方法交叉驗(yàn)證也能為自己的論文質(zhì)量增加砝碼。

 

此外，Cre-LoxP動(dòng)物雖然在對(duì)基因的空間特異性研究方面已經(jīng)很成熟了，也存在轉(zhuǎn)入的啟動(dòng)子在多個(gè)組織中同時(shí)表達(dá)的情況，而如果這時(shí)我們的焦點(diǎn)僅僅是一種組織，那么其他組織中Cre的表達(dá)仍然會(huì)對(duì)我們的研究精度產(chǎn)生干擾。AAV的定點(diǎn)注射恰好可以完美地解決這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槲覀冎恍枰�在自己想要研究的組織中注射病毒就好，區(qū)域特異性很強(qiáng)。

 

為了進(jìn)一步利用好手頭的基因編輯鼠，AAV注射的方案也可以分為兩種，一種是如果手頭有LoxP的大鼠，可以注射AAV包裝組織特異性的Cre；反過(guò)來(lái)，如果手頭有Cre大鼠，則可以反過(guò)來(lái)注射包裝了連端有LoxP位點(diǎn)的目的基因或者其他元件的病毒。不過(guò)一般而言，對(duì)組織特異性Cre進(jìn)行AAV包裝更為常見(jiàn)。

 

圖3. AAV病毒包裝DNA與大鼠聯(lián)用進(jìn)行條件性表達(dá)

 

雖然AAV介導(dǎo)的條件性基因編輯有著上面所提到的諸多優(yōu)點(diǎn)，但凡是有利就必有其弊。AAV注射的弊端首先就在于其包裝片段長(zhǎng)度短，這就注定一些大片段的基因無(wú)法采用這種方法，使其適用范圍受到局限，經(jīng)常需要在報(bào)告基因等附件基因元件上做出取舍，Cre基因之前啟動(dòng)子的選擇也比較受限制；另外一點(diǎn)就是有一定的學(xué)習(xí)成本，這個(gè)成本包括時(shí)間和資金花費(fèi)，尤其是腦部注射，由于要精確到不同的腦區(qū)，而老鼠的腦子本來(lái)就不大，而且由于年齡，性別，品系，生長(zhǎng)史等原因，每只動(dòng)物都并不會(huì)完全長(zhǎng)成圖譜中的樣子，所以要精確掌握給藥位置是需要狠下一番功夫的；病毒由于是外源物，并非細(xì)胞本身產(chǎn)生，因此會(huì)出現(xiàn)注射部位的濃度分布不均，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，這很好理解，注射的中心部位的病毒含量肯定是要高于周邊的。最后就是成本問(wèn)題，雖然大多數(shù)情況下采用AAV進(jìn)行條件性表達(dá)的成本是要低于Cre-LoxP小鼠的，但也有兩種情況例外，首先就是如果我們采用的是全身性注射，病毒的消耗量也是很大的，而且隨著注射病毒動(dòng)物數(shù)量的增加，病毒的花費(fèi)可以說(shuō)是線(xiàn)性增長(zhǎng)的；而采用雜交小鼠的方案則不同，雖然前期投入以及動(dòng)物的飼養(yǎng)都是大量經(jīng)費(fèi)的燃燒，但是一旦品系構(gòu)建成功，不出意外的話(huà)可以持續(xù)使用，后期的費(fèi)用就是飼養(yǎng)普通動(dòng)物的費(fèi)用水平了，呈邊際遞減狀態(tài)。

 

總而言之，只有充分考慮兩種方法的利弊之后再進(jìn)行決策才能將其運(yùn)用自如，在條件允許的情況下，AAV輔助條件性敲除動(dòng)物和傳統(tǒng)的Cre-LoxP動(dòng)物即有互補(bǔ)性，又能相互驗(yàn)證，在加上大鼠本身的優(yōu)點(diǎn)，在代謝，心血管和神經(jīng)等方面將具有無(wú)窮的潛力，為這些疾病提供更完善的模型，成為生物醫(yī)藥研究中不可或缺的助力。

 

 

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