在介紹實驗流程之前，我們需要了解水迷宮實驗的兩大要素，驅(qū)動力和考核內(nèi)容。水迷宮的驅(qū)動力是小鼠本能對水環(huán)境的厭惡，這就驅(qū)使小鼠想要盡快逃離這個環(huán)境，其中略低于水面的平臺就可以讓小鼠基本達成逃離水環(huán)境的目標。因此小鼠有動力盡快找到這個平臺；而考核內(nèi)容則是分析小鼠是不是能夠盡快學會用周圍的提示物（Cues）為線索找到水下平臺。絕大部分水迷宮實驗主要包括（但不限于）以下三個部分：

（1）平臺可見期實驗（2 days）；

（2）平臺隱藏期訓練（5 days）；

（3）無平臺期檢測（1 day）。

圖1. 標準水迷宮實驗日期表（不含適應環(huán)境期）

 

下面我們就來詳細介紹以下這種標準水迷宮實驗的流程:

 

小鼠對實驗環(huán)境的適應

有條件的話小鼠應該在正式實驗前1周移入水迷宮實驗房間進行飼養(yǎng)。如果沒有這樣的條件，也應該盡量將小鼠至少連續(xù)三天每天移入水迷宮房間2-4小時，適應實驗環(huán)境。同時實驗人員也應該在實驗前與小鼠有連續(xù)5天以上，每天2min的熟悉過程。

PS：相對新物體識別和自主交替實驗，逃生欲望算是一個比較強的動力，所以水迷宮中適應環(huán)境并沒有剛才說的兩個實驗那么關鍵，但為了增加實驗的可靠性，讓小鼠熟悉飼養(yǎng)環(huán)境和實驗人員仍然是必不可少的。

 

平臺可見期實驗（“體檢”期）

（1）按照前文所述的方法搭建水迷宮實驗設施，個人傾向于Cue放在水池內(nèi)部，因為水池內(nèi)部的Cue更容易被小鼠看到。

（2）將水池分為四個象限，分別用N，S，W，E命名，此外再設定8個放小鼠下水的方位，從9點鐘的1號位置開始逆時針到10點鐘位置的8號位，當然這種位置的序號是可以自定義的。

（3）每天每只小鼠進行4次實驗，前兩次和后兩次平臺分別放在兩個不同的位置，如圖2所示，放小鼠的位置在平臺所在象限對面象限的兩側(cè)位置，例如平臺如果在N位置，放置小鼠的位置就在2和4。

（4）放置小鼠時小鼠面朝水池壁，下水輕柔，不要讓小鼠嗆水（這個步驟在無論是在平臺隱藏期還是Probe時期都是一樣的）。

（5）小鼠在水中自由探索1分鐘，超過1分鐘未找到平臺，則引導小鼠到平臺并讓小鼠在平臺上停留15s（這個步驟在平臺隱藏期是一樣的）。

（6）將小鼠擦干，防止熱量損失過多，有條件的話擦干后的小鼠放在31-33度左右的鼠籠中進行“烘烤”一分鐘左右再放入臨時籠中（不要放入長期飼養(yǎng)用的籠子里）。

（7）清理水池表面的糞便（可以連續(xù)2-4只小鼠實驗后清理，在水迷宮實驗中少量糞便影響不大）。

（8）每只小鼠兩次下水的時間間隔不少于20min（因為涉及更換平臺方位，所以每次都將所有實驗用的小鼠完成試驗后再開始下一輪比較好）。

（9）平臺可見的實驗有時1天以內(nèi)就可以檢測到小鼠運動和視力是否有明顯問題，所以根據(jù)實驗情況，有時也只需要一天時間。

圖2. 平臺可見期實驗方案

 

平臺隱藏期實驗（訓練期）

（1）平臺高度低于水平面0.5cm-1cm左右，在所有隱藏平臺期內(nèi)的平臺位置固定，為了方便描述，我們將平臺的位置設定為E。

（2）將小鼠面朝水池壁輕輕放入水中。每天針對每只小鼠的四次實驗，小鼠都是從2，3，8，7這幾個位置隨機放入（其實是偽隨機，每天四個位置都要用到，只是順序可以隨機），圖3中就是偽隨機的實驗方案示意圖。

（3）其余步驟和平臺可見期的步驟（3）—（8）相同。

（4）記錄全部過程影像資料以便分析。

圖3. 平臺隱藏期實驗方案

 

無平臺探索期實驗（測試期）

平臺隱藏期實驗完成后一段時間（具體時間間隔根據(jù)實驗目的決定），撤去平臺，將小鼠從1號位放入（平臺隱藏期一直沒有用到的離目標平臺最遠的位置），記錄小鼠運動過程以便后來分析。

圖4. 無平臺探索期實驗方案

 

反轉(zhuǎn)記憶實驗（Spatial Reversal）

這個階段并非必須，但是有些基因的改變或者藥物的處理并不會使小鼠在常規(guī)的水迷宮學習階段或者探索實驗階段出現(xiàn)明顯的差異，而主要是影響小鼠記憶的靈活性和對固有認知根據(jù)現(xiàn)實情況進行調(diào)整的能力，反轉(zhuǎn)試驗就是應用在這種更為精細的學習記憶能力的差異研究之中，對基因的功能和藥效進行細致的檢測。

 

可調(diào)整參數(shù)及注意事項

水迷宮動物操作的四個階段中，可以調(diào)整的參數(shù)不少，而且這些參數(shù)的調(diào)整，很大程度上也影響著實驗結(jié)果。下面我們來看看每個階段可調(diào)整因素對實驗結(jié)果的影響吧。

 

首先是我們從宏觀上看，適應期和平臺可見期的實驗都不是必須的，更有甚者在論文中連無平臺探索期的實驗結(jié)果也沒有展示。實際上，只有平臺隱藏期的實驗也能夠?qū)π∈蟮膶W習記憶能力起到一定的檢測作用。但是個人非常不推薦這么做，首先這樣會少了很多對照實驗的數(shù)據(jù)，而且這些實驗中獲得的運動能力和視力的對照數(shù)據(jù)本身也是非常有意義的；其次這樣文章中也會少了不少論據(jù)，而且大多數(shù)雜志是不接受這種極簡版的實驗結(jié)果的。還有就是如果沒有Probe期實驗，很難排除一些采用非空間記憶方式完成水迷宮任務的小鼠，比如有的小鼠會采取保持與水池邊緣一定距離繞圈的策略。

 

另外實驗人員與小鼠熟悉的過程非常重要，而且小鼠本身就容易焦慮或者抑郁，如果沒有讓小鼠放下戒心，影響的就不止是小鼠的學習記憶能力了。

 

另外就是可見平臺期前也可以進行一次水池適應實驗（60分鐘），就是將小鼠放入水池中熱一下身，但不是必須的。

 

關于可見平臺期的試驗，首先是這個實驗的持續(xù)時間可以是1天或者1天以上，但是不宜過多；還有就是這個實驗可以放在實驗的最開始階段，也可以放在Probe實驗之后，甚至在隱藏平臺期中也可以插入一天進行。一般而言，如果動物年齡比較大或者水迷宮前有傷害性操作（手術和藥物），需要將可見平臺實驗放在隱藏平臺實驗之前，提前確認運動能力和視力，防止體弱小鼠在漫長的隱藏平臺期實驗中死亡。

 

平臺隱藏期是最重要的實驗階段，并且一般而言，這個階段的實驗耗時最長（4-7天最為常見），如果發(fā)現(xiàn)小鼠已經(jīng)基本達到尋找平臺的時間極限之后就可以不用繼續(xù)了，這個極限的時間一般是小鼠尋找平臺的平均時間，接近15s左右。

 

此外，在基礎的水迷宮實驗基礎上，還可以通過延長Probe實驗的次數(shù)，研究動物對原有平臺位置記憶的消退時間。不過，對平臺位置記憶的消退時間有兩種解讀方式，如果對小鼠經(jīng)過多次Probe實驗還“冥頑不靈”，花大量時間堅守在原平臺所在象限進行尋找，我們就一方面可以說小鼠的記憶持續(xù)時間很久，另一方面也可以認為小鼠的記憶可重塑性較弱。

 

如果我們在Probe實驗之后，馬上開始另一次隱藏平臺的實驗，而這次隱藏平臺實驗的平臺位置與第一次隱藏平臺時不同，那么在這個試驗過程中檢測的就是小鼠的二次學習能力，又叫反向訓練。你可以理解為將原有的過時的位置信息進行修正，找到新的標志物與平臺位置的聯(lián)系。這種方法一般用于對更輕微的神經(jīng)損傷進行檢測。同時在第二次隱藏平臺的訓練過程之后，還可以進行Probe實驗。

 

小結(jié)

相比于大多數(shù)學習記憶相關的行為學實驗，水迷宮有如下優(yōu)點：

1. 驅(qū)動力強，小鼠不喜歡水泡的狀態(tài)，希望盡快擺脫，因此小鼠會使出渾身解數(shù)逃離。

2. 其他實驗中存在的氣味作為線索的因素基本消失，小鼠隨時排泄排便，極易在行為學設備中留下氣味。這些氣味會干擾下一只小鼠的實驗狀態(tài)并影響實驗結(jié)果，而這些都在大量水的稀釋下趨近于最低。

3. 訓練階段和實驗階段可以獲得大量小鼠的行為數(shù)據(jù)，如找到平臺的時間、路程、策略，小鼠不同階段速度和運動軌跡的比較等等，從而對小鼠的行為進行更精確的分析。

4. 相對禁食對老年小鼠健康的影響，電擊造成年輕小鼠的精神創(chuàng)傷而言，傷害要小一些。

5. 非條件反射實驗，省去了部分學習時間。

 

當然水迷宮也不是毫無缺點，相比于新物體識別和巴恩斯迷宮，水迷宮對小鼠的刺激還是比較強的，年老或者疾病小鼠在實驗中死去的情況并不罕見。

 

總而言之，水迷宮實驗對空間記憶和參考記憶的檢測是相當靈敏且有效的，不過，其環(huán)境搭建要求比較嚴格，實驗過程中需要有嚴格的對照數(shù)據(jù)分析排除非學習記憶因素對實驗結(jié)果的干擾，對實驗操作員有很高的要求，除了需要詳細了解原理之外，實際操作經(jīng)驗也是相當重要的。

 

好了，關于水迷宮實驗部分就介紹到這里，下一期我們將介紹水迷宮實驗中所獲取主要數(shù)據(jù)的分析方法。

 

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參考文獻：

1. Erik D. Roberson. Alzheimer's Disease and Frontotemporal Dementia[M]. Humana Press, 2011.

2. Vorhees C V, Williams MT. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. (2006) 1:848–58. doi: 10.1038/nprot.2006.116.