童話里的故事都是騙人的，但每個人心中的童話是美好的，充滿著希望和期待。面對新冠病毒疫情時，正是這樣的希望支撐著大家不斷地堅持和奮斗。7月份以來，科學(xué)家們通過自主研發(fā)、團(tuán)體合作，中和抗體藥物的開發(fā)以及疫苗II期臨床實驗獲得進(jìn)一步成功，讓人們更加期待在后續(xù)實驗中人類與病毒的抗?fàn)幱袀�好的結(jié)果。

 

在此，我們將對中和抗體和疫苗設(shè)計的相關(guān)問題進(jìn)行討論：中和抗體研究的意義？新冠疫苗目前的成果？我們?nèi)绾瓮ㄟ^模式動物來驗證疫苗的安全及有效性？

 

中和抗體研究

當(dāng)病毒侵入機體時，機體會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體對病毒進(jìn)行中和，減少病毒對機體的侵害，阻止病原微生物通過黏附靶細(xì)胞受體來入侵細(xì)胞。

 

一般來說，對于像新冠肺炎等甲類傳染病的研究，需要在3級以上生物安全實驗室中進(jìn)行。但在病毒學(xué)研究的進(jìn)程中，研究者們發(fā)現(xiàn)，假病毒的應(yīng)用在探究病毒中和性抗體藥物以及疫苗的研究中大有用途，由于假病毒大多用于病毒展示沒有傳播能力等特質(zhì)，使得對相應(yīng)病毒研究的實驗環(huán)境并不需要格外嚴(yán)格，只要在生物安全2級以上就可以操作。

 

對于冠狀病毒假病毒中和抗體的研究，我們還得從SARS說起，早在2005年，SARS病毒突然爆發(fā)，搞得人們措手不及。雖然說SARS病毒來去匆匆，使得很多相關(guān)研究被擱淺，但仍然有很多項目被執(zhí)行了下來，對我們應(yīng)對今天的SARS-CoV-2不無借鑒意義。首先，我們來看一下，2005年英國倫敦大學(xué)Robin A. Weiss教授團(tuán)隊在Emerging infectious Disease上發(fā)表的文獻(xiàn)：Longitudinally Profiling Neutralizing Antibody Response to SARS Coronavirus with Pseudotypes。文中指出，SARS-CoV棘突蛋白S是中和抗體的主要靶標(biāo)，通過構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒S相關(guān)假病毒，成功制備SARS-CoV的中和抗體，并發(fā)現(xiàn)該抗體對患者SARS-S蛋白具有中和反應(yīng)。這項研究對于自然感染過程中的中和抗體效價及疫苗臨床前評估具有重要的意義。同時，研究者在小鼠和倉鼠中進(jìn)行的臨床前研究發(fā)現(xiàn)中和抗體可明顯抵御活病毒的攻擊，這些研究結(jié)果說明，中和抗體藥物的研究在一定程度上可以抵抗病毒的侵襲。

 

我們再把時間拉回到2020年3月，中國醫(yī)科院病原微生物研究所在Nature Communication上發(fā)表研究論文，利用假病毒系統(tǒng)證明了SARS-CoV-2-S 蛋白在病毒入侵細(xì)胞時表現(xiàn)出哪些特征，并對其與SARS-CoV產(chǎn)生的免疫交叉反應(yīng)進(jìn)行了闡述。該研究使用慢病毒SARS-CoV-2-S假病毒系統(tǒng)，確定了Huh7、Vero81、LLCMK2、Calu3等細(xì)胞對于該系統(tǒng)易感，文中還詳細(xì)論述了病毒與受體ACE2結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞的途徑。我們知道，CoV S蛋白是典型的I類病毒融合蛋白，需要蛋白酶切割來激活S蛋白的融合潛能，在病毒S蛋白的S1和S2之間進(jìn)行切割，根據(jù)病毒株和細(xì)胞類型，CoV S蛋白可能會被一種或幾種宿主蛋白酶切割，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、跨膜絲氨酸蛋白酶2（TMPRSS-2）、TMPRSS-4或人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶（HAT）。這些蛋白酶在靶細(xì)胞上的存在很大程度上決定了冠狀病毒是通過質(zhì)膜還是通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

 

圖1. SARS-CoV-2-S假病毒侵入細(xì)胞

(Xiuyuan Ou et al. 2020)

 

研究進(jìn)一步使用可溶性hACE2的流式細(xì)胞術(shù)和競爭抑制實驗分析驗證了SARS-CoV-2和SARS-CoV兩種病毒的S蛋白都以hACE2作為病毒結(jié)合的受體。

 

冠狀病毒S蛋白是病毒毒力的關(guān)鍵因子，是決定病毒毒力、組織嗜性和宿主范圍的關(guān)鍵部分，也是中和抗體和疫苗設(shè)計的主要靶標(biāo)。那么對于SARS-CoV-2-S與SARS-CoV-S產(chǎn)生的免疫交叉反應(yīng)是如何體現(xiàn)的呢？

 

圖2. SARS和COVID-19患者血清的有限交叉中和反應(yīng)

(Xiuyuan Ou et al. 2020)

 

研究發(fā)現(xiàn)康復(fù)的SARS患者的血清對SARS-CoV S假病毒顆粒的入侵表現(xiàn)出強烈抑制作用，并且對SARS-CoV-2 S假病毒顆粒具有適度的中和活性。

 

隨著時間的推移，7月份中和抗體的研究結(jié)果逐漸浮出水面，各種友好的結(jié)果讓我們對抗疫的未來充滿了信心。7月9日，北京大學(xué)基因組學(xué)先進(jìn)創(chuàng)新中心（ICG）和生物醫(yī)學(xué)先鋒創(chuàng)新中心（BIOPIC）等單位合作在Cell上發(fā)表文獻(xiàn)，通過對新冠肺炎康復(fù)患者的B細(xì)胞進(jìn)行高通量單細(xì)胞測序，鑒定出了針對SARS-CoV-2的有效中和抗體。

 

圖3. SARS-CoV-2中和抗體的產(chǎn)生

(Yunlong Cao et al. 2020)

 

研究通過高通量scRNA/VDJ-seq測序，鑒定了8,558個IgG1+抗原結(jié)合克隆型，從60名康復(fù)患者中發(fā)現(xiàn)14種有效的SARS-CoV-2中和抗體，還用SARS-CoV-2真病毒和SARS-COV-2 VSV假病毒系統(tǒng)進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)其中最有效的中和抗體是BD-368-2，而且BD-368-2對感染SARS-COV-2的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出較強的治療和預(yù)防作用。同時，研究利用了生物信息學(xué)的分析方法，對單克隆抗體CDR3H結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，驗證實驗發(fā)現(xiàn)，mAb中與SARS-CoV中和抗體m396高度相似的CDR3H結(jié)構(gòu)對SARS-CoV-2具有非常高的中和效力。

 

圖4. BD-368-2對感染SARS-CoV-2的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠有較高的治療和預(yù)防作用

(Yunlong Cao et al. 2020)

 

7月23日，中科院生物物理所王祥喜研究員與多個團(tuán)隊合作，通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了冠狀病毒抗體庫，經(jīng)過高通量篩選鑒定出了一株對β冠狀病毒具有廣譜中和能力的抗體H014。

 

圖5. 交叉中和抗體H014的驗證

(Zhe Lv et al. 2020)

 

人源化單克隆抗體H014，通過與S受體結(jié)合域（RBD）結(jié)合，可有效地中和假病毒SARS-CoV-S PSV以及真病毒SARS-CoV-2。在hACE2小鼠模型中，H014的給藥可降低感染肺部的SARS-CoV-2病毒滴度，減輕肺部病理變化。

 

以上研究為我們提供了中和抗體篩選的方式以及相應(yīng)的驗證結(jié)果，對抗病毒藥物的開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義，同時，為疫苗靶點的探索指明了方向。

 

新冠疫苗的研發(fā)進(jìn)展

截止7月21日，世界范圍內(nèi)已經(jīng)有25種新冠候選疫苗進(jìn)入臨床試驗階段，其中至少有4種疫苗進(jìn)入III期臨床試驗。

 

疫苗是將病原微生物經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制備的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。傳統(tǒng)的疫苗分為人工主動免疫和被動免疫疫苗，人工主動免疫疫苗分為三類，一是滅活疫苗，二是減毒活疫苗，三是類毒素疫苗。人工被動免疫的方式有以下四種，一是抗毒，二是人免疫球蛋白制劑，三是細(xì)胞因子制劑，四是單克隆抗體制劑。兩種方式的免疫均能使機體增強抗病能力，減少傳染病的發(fā)生。科技的進(jìn)步帶來了疫苗制備方式的創(chuàng)新，根據(jù)不同制備方式，目前已有的新型疫苗類型有亞單位疫苗、結(jié)合疫苗、合成肽疫苗和基因工程疫苗（重組抗原疫苗/重組載體疫苗/DNA-RNA疫苗/轉(zhuǎn)基因植物疫苗）。

 

回到新冠疫苗的研究上，2020年7月14日，美國Moderna公司研發(fā)的候選疫苗mRNA-1273在100mg免疫劑量下可激發(fā)人體較好的中和抗體反應(yīng)和偏向于Th1 CD4型細(xì)胞免疫應(yīng)答，不良反應(yīng)相對溫和，后期的臨床試驗正在進(jìn)行。7月20日，牛津大學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院陳薇院士團(tuán)隊腺病毒載體疫苗 ChAdOx1 nCoV-19（AZD1222）II期臨床結(jié)果揭曉，令人興奮的是，該研究評估了腺病毒Ad5載體的候選COVID-19疫苗的免疫原性和安全性，確定候選疫苗的合適劑量用于下一步的有效性研究。同在7月20日，德國 BioNTech 公司聯(lián)合美國輝瑞等機構(gòu)在預(yù)印本網(wǎng)站medRxiv發(fā)布了RNA疫苗的1/2期臨床試驗結(jié)果。通過脂質(zhì)納米顆粒處理的RNA疫苗能激發(fā)受試者細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，BNT162b1編碼SARS-CoV-2棘突蛋白的受體結(jié)合域（RBD），BNT162b1表達(dá)的RBD抗原與T4纖維蛋白衍生的“foldon”三聚結(jié)構(gòu)域融合，通過多價重組增加其免疫原性。

 

這些成果的展示，體現(xiàn)了科技的發(fā)展與人類的進(jìn)步，但是在疫苗安全效用評估的過程中，我們不得不充分考慮到ADE（antibody-dependent enhancement）效應(yīng)的出現(xiàn)。

 

那么什么是ADE呢？早在1964年，Hawkes等在蟲媒病毒的研究中提到了“抗體依賴性感染增強”的假說，ADE主要表現(xiàn)為病毒在低濃度免疫血清中的復(fù)制被促進(jìn)而不是被抑制，這也是當(dāng)初登革熱出血癥和登革熱休克綜合癥產(chǎn)生的主要原因。而對于新冠病毒，是否也會出現(xiàn)這樣一種令人擔(dān)憂的現(xiàn)象呢？

 

圖6. 冠狀病毒抗體反應(yīng)的潛在結(jié)果

a. 在抗體介導(dǎo)的病毒中和過程中，與病毒刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）以及其他結(jié)構(gòu)域結(jié)合的中和抗體可防止病毒黏附于受體ACE2上。

b. 在感染的抗體依賴性增強過程中，低質(zhì)量、少量和非中和性抗體會通過Fab結(jié)構(gòu)域與病毒顆粒結(jié)合。單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上表達(dá)的Fc受體（FcR）與抗體Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合并促進(jìn)病毒的進(jìn)入和感染。

c. 在抗體介導(dǎo)的免疫增強過程中，低質(zhì)量、少量和非中和性抗體與病毒顆粒結(jié)合。Fc結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合后，F(xiàn)cR啟動信號，促炎性細(xì)胞因子上調(diào)同時抗炎性細(xì)胞因子下調(diào)。免疫復(fù)合物和病毒RNA通過Toll樣受體3（TLR3）、TLR7或TLR8發(fā)出信號以激活宿主細(xì)胞，從而導(dǎo)致免疫病理學(xué)現(xiàn)象的發(fā)生。

 

研究表示，在SARS-CoV感染中，ADE是由于病毒與在不同免疫細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞）上表達(dá)的Fc受體（FcR）結(jié)合而發(fā)生的。預(yù)先存在的SARS-CoV特異性抗體可能會促進(jìn)病毒進(jìn)入表達(dá)FcR的細(xì)胞。實際上，通過ADE感染巨噬細(xì)胞不會導(dǎo)致有效的病毒復(fù)制和脫落。相反，病毒抗體免疫復(fù)合物的內(nèi)化可通過FcRs5激活髓樣細(xì)胞來促進(jìn)炎癥和組織損傷。通過此途徑進(jìn)入的病毒可能會與模式識別受體TLR3、TLR7和TLR8結(jié)合。巨噬細(xì)胞通過ADE吸附SARS-CoV病毒導(dǎo)致TNF和IL-6的產(chǎn)生升高。因此，在對疫苗進(jìn)行研發(fā)的過程中，我們不得不考慮可能出現(xiàn)的ADE效應(yīng)。那么，如何能夠最大限度地避免該現(xiàn)象在人體中發(fā)生，那就是疫苗應(yīng)用前的模式動物安全性驗證。

 

模式動物應(yīng)用于疫苗安全性驗證

6月份，趙金存教授團(tuán)隊研發(fā)制備腺病毒載體新冠小鼠模型，通過實驗驗證，發(fā)現(xiàn)該方法所制備的小鼠模型能夠產(chǎn)生有效的中和抗體，對疫苗和藥物評價具有非常重要的意義。同時，華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)部也利用AdV-hACE2模型制備了高效中和抗體，到7月份，疫苗的研究進(jìn)展相繼被報道，美國Moderna公司開發(fā)的mRNA-1273和德國BioNTech等機構(gòu)研發(fā)的納米顆粒mRNA疫苗取得了有效進(jìn)展，激發(fā)了受試者產(chǎn)生免疫應(yīng)答并產(chǎn)生中和抗體。我國陳薇院士團(tuán)隊聯(lián)合牛津大學(xué)制備的腺病毒載體疫苗ChAdOx1 nCoV-19同樣產(chǎn)生了令人期待的好結(jié)果。

 

這些研究，無一不讓我們更加期待模式動物的廣泛應(yīng)用。疫情給我們最深的體會大概就是，有史以來全民對病毒的了解恐怕沒有比新冠病毒更深入的了。隨著科技的進(jìn)步，全球醫(yī)療健康水平會進(jìn)入到一個新的階段，人們對生命本質(zhì)的了解會更加透徹。

 

童話很美好，我們的未來也可期。

 

賽業(yè)個性化ACE2小鼠：兩大技術(shù)、三大品系、多種打靶方案

 

賽業(yè)生物作為模式動物領(lǐng)域的領(lǐng)軍企業(yè)，在新冠肺炎疫情爆發(fā)初期，便組織研發(fā)團(tuán)隊全力開發(fā)新冠小鼠模型。我們利用自主研發(fā)的TurboKnockout技術(shù)和經(jīng)過優(yōu)化的CRISPR-Pro技術(shù)同步開展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三種背景品系的人源化ACE2小鼠制備，并綜合考慮不同基因編輯方式的優(yōu)缺點，設(shè)計了多種基因打靶方案與構(gòu)建策略，以滿足您不同研究目的和不同應(yīng)用方向的需求。您可以查看次條推文了解具體的ACE2小鼠打靶方案，如有需要，歡迎后臺留言后者聯(lián)系我們咨詢~

 

參考文獻(xiàn)：

1. Nigel J. Temperton, Paul K. Chan, Graham Simmons et al. Longitudinally Profiling Neutralizing Antibody Response to SARS Coronavirus with Pseudotypes. Emerging infectious Disease. 2005.

2. Bisht H, Roberts A, Vogel L, et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein expressed by attenuated vaccinia virus protectively immunizes mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004.

3. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, et al. A DNA vaccine induces SARS coronavirus neutralization and protective immunity in mice. Nature. 2004.

4. Xiuyuan Ou, Yan Liu, Xiaobo Lei, et al. Characterization of spike glycoprotein of

SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nature communication. 2020.

5. Yunlong Cao, Bin Su, Xianghua Guo，et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identifified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells. Cell. 2020.

6. Zhe Lv, Yong-Qiang Deng, Qing Ye, et al. Structural basis for neutralization of SARS-CoV-2 and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody. Science.2020.

7. Feng-Cai Zhu, Xu-Hua Guan, Yu-Hua Li, et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo controlled, phase 2 trial. The Lancet. 2020.

8. L.A. Jackson, E.J. Anderson, N.G. Rouphael, et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report. The new england journal of medicine. 2020.

9. Ugur Sahin, Alexander Muik, Evelyna Derhovanessian，et al. Concurrent human antibody and TH1 type T-cell responses elicited by a COVID-19 RNA vaccine. medRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.17.20140533.

10. Nelson Lee, P.K.S Chan, Margaret Ip, et al. Anti-SARS-CoV IgG response in relation to disease severity of severe acute respiratory syndrome. J. Clin. Virol. 2006.

11. David J DiLillo, Peter Palese, Patrick C Wilson et al. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J. Clin. Invest. 2016.

12. Akiko Iwasaki and Yexin Yang. The potential danger of suboptimal antibody responses in COVID-19. Immunology. 2020.

13. Jing Sun, Zhen Zhuang, Jian Zheng et al. Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19 Pathogenesis Vaccination, and Treatment. Cell. 2020

14. Ahmed O. Hassan, James Brett Case, Emma S. Winkler et al. A SARS-CoV-2 infection model in mice demonstrates protection by neutralizing antibodies. Cell. 2020

15. Shi-Hui Sun, Qi Chen, Hong-Jing Gu et al. A mouse Model of SARS-CoV-2 infection and Pathogenesis. Cell host & microbe. 2020.