水迷宮（Water Maze）是目前阿爾茨海默病（Alzheimer Disease, AD）研究中使用得最多的行為學(xué)實驗方法，主要用于檢測嚙齒類動物的空間記憶能力。該方法是由理查德-莫里斯（Richard Morris）于1981年發(fā)明，并在三年后對其實驗流程進行了進一步的完善，為了表示對發(fā)明者的紀(jì)念和尊重，人們把這種實驗叫做“莫里斯水迷宮（Morris Water Maze，WMW）”。

 

從80年代初被發(fā)明之后，水迷宮逐漸成為AD認知記憶實驗中的“主力”。當(dāng)我們同時以阿爾茨海默癥和行為學(xué)實驗名稱進行搜索時，水迷宮的檢索所得項目要遠多于其他任何行為學(xué)實驗（圖1A）。而且水迷宮對AD行為學(xué)研究的統(tǒng)治地位是與日俱增的，在1995年之前，水迷宮實驗占列入統(tǒng)計的7種行為學(xué)文獻總數(shù)的44%（圖1B），但是到了2020年，這一比例已經(jīng)增長到了54%（圖1C）。由此可見AD研究中水迷宮所處的“統(tǒng)治地位”。

 

圖1. 水迷宮是AD研究中最重要的行為學(xué)實驗

 

但是和許多動物行為學(xué)實驗一樣，不同的論文中該實驗無論是在器材規(guī)格，實驗流程以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面都有很大的差異，往往令人疑惑不解，搞不清楚水迷宮實驗到底有沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，哪些參數(shù)是可以更改的，哪些參數(shù)是需要慎重考慮的。為了解答這些疑惑，我們計劃從設(shè)備、主要流程和統(tǒng)計分析三個篇章來對水迷宮進行解析，希望能讓大家對水迷宮實驗有一個大致的了解，對影響水迷宮實驗的各種因素做到心中有數(shù)。需要注意的是，為了敘述方便，這里我們所采用的流程和實驗器材規(guī)格都是針對小鼠的，雖然大鼠實驗中參數(shù)會有一定的變化，但是原理是一樣的。今天我們從設(shè)備即器材的選擇開始講。

 

水池（Tank）

水迷宮實驗的主體是一個圓形的水池，水池的內(nèi)徑一般為120-130cm之間。雖然也有研究采用的是直徑100cm或者180cm規(guī)格的水池，但水池過大會造成小鼠需要探索的面積增大，學(xué)習(xí)時間過長，并且小鼠的嬌小體型不利于熱量的保存，在水中焦躁地游泳進一步加劇了熱量的消耗，過長的游泳時間不利于小鼠身心健康，甚至危及生命；另一方面，過大的水池也會造成操作困難，尤其是在引導(dǎo)水池中未完成任務(wù)的小鼠走上平臺的過程中，小鼠如果位于水池中間，就是考驗實驗人員手臂長度的時候了。反過來，水池過小會導(dǎo)致實驗難度過低，有可能不能對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的小鼠和正常小鼠進行有效區(qū)分，可以理解為考題太容易，學(xué)習(xí)成績差的學(xué)生和優(yōu)等生都能做出來。

 

水池一般為50-60cm高，其中水深30cm，留出20-30cm的邊緣可以用來放置提示方位用的標(biāo)志物（Cue）。邊緣不宜過低，因為低于10cm的話小鼠在游泳過程中可能會跳出水池，另一方面也沒有足夠的空間貼標(biāo)志物。水池一般會由支架支撐起來，高度上方便實驗人員進行操作。

 

圖2. 小鼠水迷宮尺寸

 

如果有條件，水池最好有完整的溫控系統(tǒng)，即溫度檢測和上升降溫裝置（主要是升溫），將水溫的波動控制在最低水平。而且這種溫控系統(tǒng)的升溫設(shè)備需要盡量均勻分布，否則水溫不均也會影響實驗結(jié)果。

 

水迷宮房間內(nèi)的給排水系統(tǒng)可以大大增加實驗的便利性，因此建議設(shè)置專門的房間用于水迷宮實驗，并能直接安裝向水池提供熱水的龍頭。

 

如果沒有像實驗用水浴鍋那樣有自動溫控裝置的水池的話，為了實驗的連續(xù)性，可以用蓄水量更多的水池（即高度超過60cm），更多的水能更長時間地保持水溫。不過，仍然需要溫度計進行監(jiān)控，使水溫維持在20-22度之間（其實22度是最好的，但是實際上沒有自動溫控系統(tǒng)的話很難維持，所以在溫度低于20度之前要及時加熱）。水溫過低會導(dǎo)致小鼠體溫降低，身體機能下降，嚴(yán)重的可能會導(dǎo)致體弱小鼠死亡，從而影響實驗結(jié)果；不過如果水溫高到一定程度后，小鼠可能會因為體感溫度舒適而導(dǎo)致尋找平臺的動力減弱，也不利于實驗。

 

為了方便動物行為采集系統(tǒng)的工作以及防止小鼠看到水下的逃生平臺，一般針對白色的小鼠，水池材質(zhì)是深色即可，不需要在水中添加顏料；而白色的鈦白粉則可以用于黑色或者灰色小鼠的行為實驗。值得一提的是，有研究表明水的顏色對小鼠尋找平臺沒有影響，這可能是小鼠游泳時抬頭運動或者光線折射的緣故。但保險起見，進行深色動物實驗的同時也加入白色顏料，主要是為了增加對比度，提高視頻分析系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

 

平臺（Platform）

逃生平臺一般為直徑7-10厘米的圓形（雖然方形平臺也常有報道，但本人更推薦圓形這種沒有尖銳突出的平臺），材料上沒有特別的要求，能讓小鼠站住不要太滑就行。

 

一般我們是靠調(diào)節(jié)水位來控制平臺是否可見的，但通常如果平臺的高度可調(diào)的話，對于訓(xùn)練期增加可見平臺實驗的方案而言會省力很多。如果是專業(yè)的水迷宮設(shè)備，一般會在水池底部設(shè)置定點卡位，這樣每次就能將平臺放在固定的地方了。另外還有可以遙控平臺高度的設(shè)備，更加方便實驗者使用。

 

此外，平臺的放置位置也是有講究的，不能太靠水池邊緣，因為這樣小鼠可能學(xué)會的是繞圈求生；也不能放得太靠水池中心，這樣小鼠也不需要記住方位，只需要在水池中心很小的范圍搜索一下就行了。如果非要選定一個方位，那么平臺圓心的位置設(shè)定在2/3半徑和1/2之間（即圖3中的紅色圓形和綠色圓形之間的環(huán)狀地帶）。

 

圖3. 平臺擺放位置（120cm直徑水池為例）

 

這里需要注意的是，平臺的直徑增大，會造成迷宮的難度降低，反之則難度增加，個人推薦根據(jù)預(yù)實驗的天花板效應(yīng)或者地板效應(yīng)確定，個人總結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)比例是水池直徑與平臺直徑之比大概是12.65左右，即水池的面積是平臺面積的160倍。結(jié)合120cm直徑水池的規(guī)格，平臺應(yīng)設(shè)置為9.5cm直徑。

 

此外，關(guān)于平臺的放置還有以下值得注意的地方，那就是如果是在隱藏平臺期，則平臺頂部與水面的距離不應(yīng)該超過1cm，因為如果平臺與水面的距離過大，小鼠還是有大半身軀浸泡在水中，因此可能會離開平臺去尋找更干燥的環(huán)境，不利于對平臺的記憶；另外如果是在可見平臺期，平臺可以放在水面以上1cm左右，太低了可能不利于小鼠觀察，太高則小鼠爬上平臺會變得困難，如果希望能加快訓(xùn)練速度，還可以在平臺上放上小旗子便于小鼠觀察；檢測期如果是進行多次的話，需要讓小鼠在每個trail的最后能夠抵達平臺，但又不能小鼠還在水中游泳，實驗人員當(dāng)面就把平臺放進去，所以只有自動化的水迷宮系統(tǒng)可以實現(xiàn)。

 

標(biāo)志物（Cue）

標(biāo)志物是動物進行空間定位的關(guān)鍵，所以相互之間的區(qū)分尤為重要。這些標(biāo)志物可以放置在迷宮之外，也可以在迷宮之內(nèi)，目的是讓小鼠游泳時能看到。水迷宮內(nèi)部的標(biāo)志物一般直徑15cm左右，而外部標(biāo)志物則沒有大小的限制。標(biāo)志物的數(shù)量一般在三個或者三個以上，相互之間形狀區(qū)分要顯著。

 

此外標(biāo)志物在水池內(nèi)部只需要10cm直徑或者邊長即可，而在外圍的話則需要相應(yīng)增大。此外小鼠對顏色并不敏感，對比強烈的形狀，小鼠的區(qū)分能力更好，PS4手柄右側(cè)的○□△×就是很好區(qū)分的形狀，增加實心和空心的區(qū)別能大大增加小鼠對這些形狀的辨識度。

 

這些標(biāo)志物的方位與象限對應(yīng)起來，一般情況下我會以東南西北四個方位的簡稱（E, S, W, N）對四個方位進行命名，標(biāo)志物也掛在或者貼在方向相應(yīng)的位置，從此不再變動（當(dāng)然有的實驗設(shè)計非常嚴(yán)謹，會通過改變Cue的方位來確定動物是利用它們來定位的，而非其他如氣味等方法），不過這里的名稱僅僅是用于區(qū)分而已，并不需要與真實的方向相對應(yīng)。

 

圖4 標(biāo)志物的放置方式[1-4]

 

視頻采集系統(tǒng)和行為學(xué)分析系統(tǒng)

視頻采集系統(tǒng)的搭建需要根據(jù)具體的實驗環(huán)境設(shè)置，需要注意的主要是反光和邊緣畸變。反光的問題可以通過增加光源或者調(diào)整攝像頭角度實現(xiàn)，邊緣畸變則需要擴大拍攝范圍，盡量使迷宮不處于邊緣。

 

好了，關(guān)于水迷宮的設(shè)備就介紹到這里，下篇文章我們將介紹水迷宮最典型的流程。賽業(yè)可為您提供用于阿爾茨海默癥研究的基因編輯鼠，如有需要，歡迎聯(lián)系我們，祝大家實驗順利~

 

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部分參考文獻及圖片來源：

[1]https://nathanshock.barshop.uthscsa.edu/integrated-physiology-aging-core/brainhealth/

[2]https://physiologicalresearch.weebly.com/water-maze-test.html

[3]https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/spatial-memory

[4]https://neuropheno.douglas.mcgill.ca/room-equipment-reservation