7月23日晚上七點(diǎn)，賽業(yè)生物云課堂開(kāi)展了主題為“阿爾茨海默病學(xué)習(xí)記憶相關(guān)行為實(shí)驗(yàn)概述”的課程，需要課件的老師可以關(guān)注“賽業(yè)生物訂閱號(hào)”，后臺(tái)留言“006”。針對(duì)答疑環(huán)節(jié)未及時(shí)解答的問(wèn)題，我們進(jìn)行了收集整理，下文為黃穎博士針對(duì)答疑環(huán)節(jié)提出的問(wèn)題給出的詳細(xì)解答。

 

 

Q1: 行為學(xué)表現(xiàn)與預(yù)期不同時(shí)的處理方法？

A: 我不知道您說(shuō)的預(yù)期是指陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照之間沒(méi)有檢測(cè)出差異，還是處理組差異，我先假設(shè)您陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是有差異的，造成檢測(cè)組沒(méi)有差異的可能無(wú)非有5種：①本來(lái)處理組就沒(méi)有明顯作用（這個(gè)需要文獻(xiàn)或者是把實(shí)驗(yàn)做到極致才能確定）；②N不夠，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差異（加N）；③實(shí)驗(yàn)難度過(guò)高，造成地板效應(yīng)（降低難度，如縮短訓(xùn)練和檢測(cè)之間的時(shí)間等）；④實(shí)驗(yàn)難度過(guò)低，造成地板效應(yīng)（提高實(shí)驗(yàn)難度）；⑤組內(nèi)變異太大（小鼠年齡，性別等的統(tǒng)一）。

 

Q2: 水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)要提前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行初篩，排除異常行為或視力的動(dòng)物嗎？

A: 年輕的動(dòng)物一般可以不用初篩，而年老（12個(gè)月以上）則需要對(duì)動(dòng)物的視力和異常行為進(jìn)行檢測(cè)。不過(guò)一方面平臺(tái)可見(jiàn)期的實(shí)驗(yàn)除了對(duì)動(dòng)物進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力和視力的檢測(cè)以外，還有幫助小鼠確定水池中有逃生平臺(tái)，幫助其下水后盡早確立行動(dòng)目標(biāo)，所以個(gè)人認(rèn)為最好提前做。

 

Q3: 造模中動(dòng)物的死亡問(wèn)題？

A: 這個(gè)問(wèn)題我理解為行為實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物的死亡。這主要涉及動(dòng)物的年齡和轉(zhuǎn)入/編輯基因的狀態(tài)，水迷宮實(shí)驗(yàn)要特別注意水溫以及游泳完成后小鼠的保溫，如果是電刺激相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，需要降低電刺激持續(xù)的時(shí)間。基因編輯動(dòng)物需要注意文獻(xiàn)中報(bào)道的小鼠生存曲線(xiàn)。

 

Q4: 常用模型都有哪些，可以做什么行為學(xué)實(shí)驗(yàn)？評(píng)價(jià)指標(biāo)是什么？

A: AD四大模型：Tg2576，APPPS1△E9，5×FAD，3×Tg。

主流行為實(shí)驗(yàn)包括：水迷宮，新物體識(shí)別，Y/T迷宮，巴恩斯迷宮，放射迷宮，恐懼記憶箱。AD還會(huì)做一些情緒相關(guān)實(shí)驗(yàn)，如礦場(chǎng)，高架迷宮等。

 

Q5: 在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中通常使用什么行為實(shí)驗(yàn)，各有什么優(yōu)缺點(diǎn)，和實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)？

A: 1. 水迷宮

優(yōu)點(diǎn)：驅(qū)動(dòng)力強(qiáng)，可獲得數(shù)據(jù)多，不用每次換小鼠清洗設(shè)備，認(rèn)可度高；缺點(diǎn)：小鼠應(yīng)激性較強(qiáng)，設(shè)備搭建和數(shù)據(jù)分析要求較高，年老小鼠容易中途死亡。

2. 新物體識(shí)別

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備搭建相對(duì)簡(jiǎn)單，可獲得數(shù)據(jù)較多，小鼠應(yīng)激性�。蝗秉c(diǎn)：物體選擇需要謹(jǐn)慎，驅(qū)動(dòng)力較弱，易受環(huán)境影響。

3. Y迷宮

優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備搭建簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)種類(lèi)較多，小鼠應(yīng)激性小老少咸宜（非饑餓驅(qū)動(dòng)）；缺點(diǎn)：清洗麻煩，隨機(jī)性較大。

注意事項(xiàng)請(qǐng)關(guān)注賽業(yè)生物公眾號(hào)，我以后會(huì)在推文里進(jìn)行詳細(xì)的介紹。

 

Q6: 阿爾茨海默病動(dòng)物模型的建立及判斷成功建立的標(biāo)準(zhǔn)？

A: 最高標(biāo)準(zhǔn)：分子（Aβ沉淀和NTF），細(xì)胞（易感區(qū)域神經(jīng)元死亡，突觸丟失），組織（腦容量減少），電生理（突觸可塑性改變），行為（記憶認(rèn)知減退）。前4個(gè)項(xiàng)目中任意兩種加上行為改變就算成功了，當(dāng)然你也可以對(duì)自己提出更高的要求。

 

Q7: 水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如何統(tǒng)計(jì)分析？

A: 具體可參考Nature Protocol，里面有很詳細(xì)的說(shuō)明《Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory》。

 

Q8: 新物體識(shí)別y迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)注意的問(wèn)題？

A: 具體可參考《The Y-Maze for Assessment of Spatial Working and Reference Memory in Mice》。

 

Q9: 目前已有model的bug，創(chuàng)建新型model的突破點(diǎn)在哪？

A: 主要的bug在于是轉(zhuǎn)基因。因?yàn)橐阅壳暗难酃鈦?lái)看轉(zhuǎn)基因?qū)儆诒容^粗糙的基因編輯技術(shù)，拷貝數(shù)不定，插入位點(diǎn)隨緣，啟動(dòng)子過(guò)于強(qiáng)大，雙/多轉(zhuǎn)基因只重病理表型，對(duì)致病的根本原因重視不夠；所以，理論上而言，目前最理想的基因編輯方式應(yīng)該是KI（同時(shí)避免隨機(jī)插入和過(guò)量插入），而且只能改變一個(gè)家族性AD基因（因?yàn)榧易逍訟D中沒(méi)有同時(shí)APP和PS1發(fā)生突變的），啟動(dòng)子用人/鼠自身的啟動(dòng)子（盡量使表達(dá)調(diào)控方式一致），而且除了小鼠外可以嘗試大鼠（大鼠的MAPT產(chǎn)物剪切方式和人類(lèi)一致性高，而且比小鼠更適合行為實(shí)驗(yàn)）。但是目前的問(wèn)題在于KI大/小鼠表型都很弱，進(jìn)而造成相關(guān)研究較少。

 

Q10: 不同模型的適應(yīng)阿爾茲海默癥治療藥物的區(qū)別，不同行為學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析？

A: 這是個(gè)大問(wèn)題，藥物和AD模型的排列組合太多了，每種AD模型連表型都沒(méi)有完全統(tǒng)一，這個(gè)問(wèn)題抱歉沒(méi)法回答。兩組比較用T-test，學(xué)習(xí)曲線(xiàn)比較用two-way ANOVA，具體建議可參考nature protocol或者JOVE中的詳細(xì)介紹。

 

Q11: 小鼠的觸屏行為也可以做AD，咋沒(méi)提到呢？

A: touch screen system是在2000年以后發(fā)明的，這次介紹的是近20年使用頻率最高的四種AD相關(guān)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，而TCS目前在AD中的論文數(shù)量與這四種還相距甚遠(yuǎn)，不過(guò)如果同學(xué)感興趣我們可以下次安排介紹剩余的行為學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)方法。

 

Q12: 探索期是從幾號(hào)放進(jìn)去的？（水迷宮最后探索期在幾號(hào)數(shù)字放下去的）

A: PPT中的方案是從平臺(tái)象限正對(duì)的位置放入（這個(gè)位置在訓(xùn)練期是沒(méi)有用過(guò)的），不過(guò)我講的方法只是我自己認(rèn)為比較好的水迷宮流程，目前也有其他的小鼠入水方案。

 

Q13: 周齡對(duì)行為學(xué)結(jié)果的影響？

A: 性成熟后兩周開(kāi)始，小鼠身體各個(gè)方面進(jìn)入最佳狀態(tài)，這個(gè)期間小鼠均一性好，年齡越大除了運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力整體減弱以外，由于生長(zhǎng)過(guò)程中積累的變量不同，差異也變大。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的每組小鼠不多，會(huì)增加組內(nèi)差異。

 

Q14: 新物體識(shí)別小鼠探索物體的總時(shí)間15s左右需要剔除嗎？觀察時(shí)間5min？

A: 有很多實(shí)驗(yàn)就是設(shè)置的15s探索時(shí)間，只要標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，15s也是常用的參數(shù)。觀察時(shí)間上限我們一般設(shè)置為5分鐘，5分鐘和10分鐘都是主流時(shí)間，不過(guò)個(gè)人覺(jué)得5分鐘就夠了，不喜歡探索的小鼠即便你多等5分鐘也意義不大。

 

Q15: 條恐freezing%閾值的選擇 ，及結(jié)果的分析？

A: FC是集成度最高的設(shè)備，不同的設(shè)備對(duì)應(yīng)不同的軟件，很多FC設(shè)備都是自帶軟件的，所以Freezing的閾值設(shè)置也有所區(qū)別，一般都是有一個(gè)移動(dòng)的范圍和持續(xù)時(shí)間作為判斷是否僵直的參考（比如小鼠在間隔為100ms的采樣頻率下，連續(xù)2s每幀畫(huà)面的移動(dòng)范圍不超過(guò)5%），但是又需要通過(guò)一些算法過(guò)濾掉呼吸引起的動(dòng)作，所以一般需要參考不同軟件的說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置。

 

Q16: 同一批小鼠可以把行為學(xué)都做了嗎？

A: 可以，但是不同的行為學(xué)之間最好間隔兩周以上，同時(shí)電刺激相關(guān)會(huì)讓小鼠產(chǎn)生應(yīng)激性的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該盡量放在行為實(shí)驗(yàn)的最后進(jìn)行，NORT一般可以做2次，我們實(shí)驗(yàn)室以前一般是在8-9月齡時(shí)做一次NORT，18-22月齡時(shí)再做一次。

 

Q17: App Ps1兩轉(zhuǎn)鼠Aβ和Tua出現(xiàn)的時(shí)間？

A: 前者6-7個(gè)月出現(xiàn)，沒(méi)有tau形成的NTF。

 

Q18: 恐懼箱的聲音刺激55Hz夠嗎？箱體風(fēng)扇的白噪音都有60Hz以上？

A: 我在課程里講的是引用了2014年JOVE文章中的設(shè)置。重點(diǎn)是作為Cue的聲音強(qiáng)度要和作為背景的聲音強(qiáng)度有明顯區(qū)別，強(qiáng)度單位是db，聲音頻率的單位是Hz，這兩個(gè)意義不一樣哦。

 

Q19: ymate需要對(duì)每個(gè)臂標(biāo)記下嗎？

A: 需要，因?yàn)閲?yán)格的Y迷宮實(shí)驗(yàn)中每個(gè)臂都要輪換著用，所以需要標(biāo)記以確保每個(gè)臂都會(huì)用到。

 

Q20: Y迷宮可以用人工分析嗎？

A: 可以，Y迷宮相對(duì)其他行為學(xué)而言因?yàn)橹挥写螖?shù)和時(shí)間，可以人工分析，但一定要錄視頻。

 

Q21: 可以在同一天做Y迷宮跟曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)嗎？

A: 沒(méi)有足夠的證據(jù)說(shuō)明不能，但是一般原則是不同行為學(xué)實(shí)驗(yàn)最好不要在一天做。我個(gè)人的理解是如果Y迷宮不是禁食的那種，且兩個(gè)實(shí)驗(yàn)加起來(lái)8小時(shí)內(nèi)就能完成，沒(méi)問(wèn)題，如果需要超過(guò)12個(gè)小時(shí)，時(shí)間跨度太大，對(duì)小鼠的節(jié)律有影響。

 

Q22: 新物體識(shí)別，分析怎么取數(shù)據(jù)？

A: 具體可參考課件P22。

 

Q23: 新物體識(shí)別怎么分析，都自己手動(dòng)計(jì)時(shí)？

A: 能用軟件就用視頻分析軟件吧，手動(dòng)計(jì)時(shí)主觀性太高，嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，手動(dòng)計(jì)時(shí)需要雙盲。

 

Q24: 水迷宮是不是需要做路徑分析？

A: 是的，雖然會(huì)多花一些時(shí)間，但路徑分析的意義在于即便小鼠在找到平臺(tái)的用時(shí)方面沒(méi)有區(qū)別，但如果路徑有區(qū)別也是能說(shuō)明問(wèn)題的，給自己多留條路比較好，而且Reviewer也經(jīng)常會(huì)問(wèn)的。

 

Q25: 水迷宮水溫的影響？

A: 水溫高，驅(qū)動(dòng)力不夠，小鼠可能選擇漂浮；水溫低小鼠熱量喪失快，應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)，容易病或死。但是對(duì)于年老小鼠（16個(gè)月以上）需要參考其他文獻(xiàn)中的水溫設(shè)定稍微提高一點(diǎn)。

 

Q26: 請(qǐng)問(wèn)上午下午做實(shí)驗(yàn)有區(qū)別嗎？

A: 有區(qū)別，但是要看什么實(shí)驗(yàn)，刺激越強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)區(qū)別越小。實(shí)驗(yàn)盡量在8小時(shí)內(nèi)完成，小鼠太多最好分批做，接近小鼠休息的時(shí)期或者小鼠剛休息完就進(jìn)行實(shí)驗(yàn)小鼠狀態(tài)的均一性較差（想想你自己上午和下午狀態(tài)是不是一致的）。

 

Q27: 能不能再講講APOE4人源化的小鼠模型，會(huì)有認(rèn)知癥狀么？

A: 單獨(dú)APOE4并不會(huì)引起AD的病理表型，但也有報(bào)道說(shuō)APOE4人源化小鼠有輕微的認(rèn)知癥狀，不過(guò)其對(duì)照是APOE3 KI（Interaction of ApoE3 and ApoE4 isoforms with an ITM2b/BRI2 mutation linked to the Alzheimer disease-like Danish dementia: Effects on learning and memory），且大部分文章并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)APOE4小鼠有認(rèn)知癥狀。

 

Q28: 新物體識(shí)別可以間隔多久再給動(dòng)物重復(fù)做？

A: 做完一個(gè)長(zhǎng)時(shí)程和一個(gè)短時(shí)程的試驗(yàn)后一般最少兩周以后才可以做，除非有什么特別的理由，物體也不要用上次實(shí)驗(yàn)用過(guò)的物體。

 

Q29: APP轉(zhuǎn)基因小鼠在實(shí)驗(yàn)中會(huì)無(wú)故死亡么？

A: AD轉(zhuǎn)基因小鼠本來(lái)死亡率就高于同窩野生型，比如APPPS1δ9一般準(zhǔn)備試驗(yàn)用鼠時(shí)雜合子就要比野生型多準(zhǔn)備20%，注意AD小鼠最初開(kāi)發(fā)時(shí)幾篇原文中的生存曲線(xiàn)，具體到不同的AD鼠略有不同，請(qǐng)根據(jù)自己所選擇的AD鼠查詢(xún)文獻(xiàn)或者咨詢(xún)供貨商。

 

Q30: 行為學(xué)軟件分析目前做到什么水平了？

A: AnyMaze和Nudols都是很好的行為學(xué)分析軟件，主要是分析迷宮類(lèi)視頻中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，攝像設(shè)備的設(shè)置和動(dòng)物環(huán)境對(duì)比是很重要的準(zhǔn)備工作，具體官方網(wǎng)站有詳細(xì)介紹。國(guó)產(chǎn)也有很多，功能大同小異，只是具體動(dòng)物運(yùn)動(dòng)識(shí)別能力可能會(huì)根據(jù)算法的差異存在區(qū)別。

 

Q31: 新物體識(shí)別，現(xiàn)在有統(tǒng)計(jì)20s閾值內(nèi)探索時(shí)？

A: 問(wèn)題貌似沒(méi)問(wèn)全，兩個(gè)物體一共探索20秒就停止實(shí)驗(yàn)，不過(guò)一般會(huì)設(shè)定探索時(shí)間上限，比如10分鐘內(nèi)沒(méi)有探索到20s的小鼠就不計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

 

Q32: 3xTg AD模型，NFT怎么染色，有成熟的方案或者試劑盒嗎？

A: 有P-tau的抗體。具體見(jiàn)https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MAPT#proteins.

 

Q33: 還想問(wèn)問(wèn)Y迷宮不是從同一條壁放的有影響嗎？

A: 無(wú)論是對(duì)自主交替這種無(wú)需饑餓誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)還是對(duì)檢測(cè)短時(shí)工作記憶的饑餓誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，嚴(yán)格的話(huà)本來(lái)就是應(yīng)該從不同的臂放入去平衡不同臂可能帶來(lái)的差異。

 

溫馨提示

賽業(yè)生物云課堂針對(duì)冠狀病毒、人源化小鼠、細(xì)胞培養(yǎng)、神經(jīng)科學(xué)等主題開(kāi)展了一系列課程，錯(cuò)過(guò)直播的老師可以通過(guò)以下方式進(jìn)行回看：

1. 搜索【賽業(yè)生物】進(jìn)入賽業(yè)官網(wǎng)點(diǎn)擊【賽業(yè)大講堂】—【賽業(yè)公開(kāi)課】，即可觀看往期課程。

2. 關(guān)注“賽業(yè)生物訂閱號(hào)”，點(diǎn)擊菜單賽業(yè)課堂—公開(kāi)課，即可觀看往期課程。

3. 在B站搜索“賽業(yè)生物”，關(guān)注我們，即可觀看我們往期的課程。

 

關(guān)于賽業(yè)

賽業(yè)生物歷經(jīng)14年發(fā)展，已服務(wù)全球數(shù)萬(wàn)名科學(xué)家，產(chǎn)品和技術(shù)已直接應(yīng)用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在內(nèi)的3600余篇學(xué)術(shù)論文。除了提供基因敲除、基因敲入、條件性基因敲除模型定制服務(wù)外，賽業(yè)生物還有專(zhuān)業(yè)的手術(shù)疾病模型團(tuán)隊(duì)，可以提供多種復(fù)雜精細(xì)的小動(dòng)物手術(shù)疾病模型；藥物篩選評(píng)價(jià)小鼠平臺(tái)可以提供從歐美行業(yè)領(lǐng)袖引進(jìn)的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿爾茨海默癥等研究的人源化小鼠；國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化無(wú)菌鼠技術(shù)平臺(tái)可以提供無(wú)菌鼠、無(wú)菌動(dòng)物定制服務(wù)、微生物菌群移植服務(wù)等基于無(wú)菌動(dòng)物模型的各類(lèi)產(chǎn)品和服務(wù)，結(jié)合賽業(yè)生物成熟穩(wěn)定的基因編輯小鼠平臺(tái)，還可幫助您研究菌群與基因的互作機(jī)制。