當(dāng)?shù)貢r間7月3日，世衛(wèi)組織首席科學(xué)家蘇米婭·斯瓦米納坦在新冠肺炎例行發(fā)布會上表示，實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，新冠病毒D614G變異可能導(dǎo)致病毒加速復(fù)制，意味著可能增強(qiáng)其傳播性。今天就讓我們從模式識別受體及免疫逃逸的角度來一起探討病毒與宿主細(xì)胞之間的恩怨情仇。

 

什么是模式識別受體

模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，存在形式多樣，不僅僅在細(xì)胞膜上表達(dá)，內(nèi)體膜、溶酶體膜和胞質(zhì)中也同樣分布廣泛。他們的作用是，監(jiān)測病毒分子的存在、啟動機(jī)體炎癥反應(yīng)和抗病毒免疫的信號傳導(dǎo)通路，使宿主免受感染。病毒入侵宿主細(xì)胞后，利用細(xì)胞內(nèi)的堿基成分產(chǎn)生新的病毒基因組，病毒復(fù)制中間體的形成和堆積，形成了病毒核酸的主要病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），而這些分子就是PRRs所識別的對象。

 

PRRs包括Toll樣受體TLR、RIG-I樣受體（RLR）和NOD樣受體（NLR），這些PRRs通過激活相關(guān)抗炎通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子和干擾素的產(chǎn)生，從而激發(fā)機(jī)體的抗病毒反應(yīng)。目前研究比較多的是通過PRRs監(jiān)測受感染細(xì)胞內(nèi)的病毒DNA，也有研究表明，RNA聚合酶III（Pol III）可將某些病毒DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，而被宿主RIG-I識別受體所識別，誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生。

 

病毒激活宿主模式識別受體

病原相關(guān)分子模式主要是指病原微生物表面某些共有的高度保守的分子結(jié)構(gòu)，比如TLR3識別dsRNA、TLR4識別LPS（脂多糖），TLR9識別CpG、RIG-I/MDA5（MDA5是胞內(nèi)模式識別受體，能夠識別入侵病毒RNA鏈，主要在非髓系細(xì)胞系中發(fā)揮抗病毒作用）識別病毒RNA等，但并不是嚴(yán)格的一一對應(yīng)，如TLR4也可以識別某些病毒的蛋白。

 

圖1. 宿主模式識別受體與病毒的相互作用（Kiva Brennan and Andrew G Bowie et al. 2010)

該圖展示的是TLR、RLR和新型病毒的PRRs感測病毒的模式。箭頭表示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NFkB激活，炎性小體產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)I型IFN和IL-1β的產(chǎn)生。星號表示每個PRRs在細(xì)胞內(nèi)的位置：*，內(nèi)體；**，細(xì)胞表面；***，胞質(zhì)的；DBD，DNA結(jié)合域；TIR，Toll-interleukin-1受體域。

 

現(xiàn)在大家對識別病毒的模式識別受體及病原相關(guān)分子模式有了大概的認(rèn)識，那么接下來我們看一下在胞膜和胞內(nèi)的PRRs分別有哪些，他們又是怎樣被激活的？

 

細(xì)胞表面TLR：TLR2和TLR4，二者是著名的監(jiān)測胞外病原體的細(xì)胞表面TLR，大家熟知的TLR2識別的是細(xì)菌脂肽和各種真菌PAMP，而TLR4主要用來監(jiān)測革蘭氏陰性菌脂多糖。隨著研究的不斷發(fā)展，TLR2和TLR4被證明在脾臟和骨髓來源的細(xì)胞中對病毒的識別起主要作用，這條路徑被認(rèn)為是經(jīng)典的抗病毒反應(yīng)過程。例如TLR4在牛痘病毒（VACV）免疫中的功能缺乏，會大大增加小鼠的病毒復(fù)制能力以及死亡率。

 

傳統(tǒng)意義上，胞內(nèi)TLR（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）與細(xì)胞表面TLR相比，更能讓機(jī)體發(fā)揮抗病毒免疫效應(yīng)，因?yàn)樗麄兡軌蜃R別病毒表面的核酸。研究發(fā)現(xiàn)，單皰疹病毒1（HSV-1）腦炎患兒的TLR3等位基因?yàn)樨?fù)顯性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TLR3的表達(dá)對于HSV-1的免疫非常重要。另有一項(xiàng)研究表明，TLR3可以識別皰疹病毒（EBV）中的單鏈非編碼RNA，在被EBV感染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有EBV編碼的小RNA（EBER）可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生類似雙鏈RNA（dsRNA）的分子，TLR3在識別EBER中具有重要作用，參與由EBV感染引起的免疫病理疾病。也有數(shù)據(jù)表明，TLR7對單鏈RNA（ssRNA）有反應(yīng)，漿細(xì)胞、樹突細(xì)胞對HIV-1編碼TLR7的配體反應(yīng)明顯不同，這也是男女HIV-1病程差異的原因之一。

 

不同PPRs對不同病毒進(jìn)行監(jiān)測，激活機(jī)體產(chǎn)生炎性小體以及白介素等發(fā)揮抗病毒的功能：研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤2（AIM2）的表達(dá)可以促進(jìn)炎性小體的產(chǎn)生；通過TBK1激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3這條途徑可以誘導(dǎo)IFNβ的產(chǎn)生，這里很典型的一個例子是鼠成纖維細(xì)胞中DAI的過表達(dá)可以增強(qiáng)I型干擾素的表達(dá)并誘導(dǎo)其他與DNA反應(yīng)相關(guān)的先天免疫基因的產(chǎn)生。這些均表明，在病原體感染機(jī)體的過程中，PRRs被激活，誘發(fā)炎性通路等抗病毒反應(yīng)因子的激活，而這些，對于后期募集免疫細(xì)胞對病毒進(jìn)行攻擊非常重要。

 

模式識別受體如何分辨敵友

病毒激活PPRs，抗病毒通路被激活，免疫反應(yīng)啟動病毒抗擊模式，但是，PRRs是怎樣將病毒核酸和自身核酸巧妙的區(qū)分開呢？如果不能區(qū)分開又會產(chǎn)生怎樣的損傷效應(yīng)呢？

 

我們已經(jīng)知道病毒復(fù)制導(dǎo)致復(fù)制中間體在受感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累，誘發(fā)PRRs發(fā)揮功能，例如RIG-I樣受體和各種其他的DNA傳感器（DAI，DExD/Hbox家族解旋酶等），AIM2受體和cGAS，這些對胞質(zhì)核酸敏感的PRRs引起機(jī)體局部抗病毒反應(yīng)，先天性免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞（DC）被募集到感染部位，通過Toll樣受體等感測感染性物質(zhì)，監(jiān)測PAMP并進(jìn)行捕捉。PAMP介導(dǎo)的PRR調(diào)節(jié)DC活性被證明對啟動針對入侵病原體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要。通過PRR直接激活DC來確保只有與傳染性生物體直接接觸的DC和當(dāng)前病原體衍生的抗原才具有誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞的能力。胞質(zhì)PRR的識別對象是病毒核酸，且這類核酸具有哺乳動物核酸缺少的特征。例如RIG-1識別的短鈍末端dsRNA結(jié)構(gòu)上的5'三磷酸基團(tuán)和MDA5識別的長dsRNA結(jié)構(gòu)上沒有的核酸。DAI（也稱為DLM-1/ZBP1）最初被描述為一種Z-DNA結(jié)合蛋白，可識別病毒DNA，具有觸發(fā)干擾素（IFN）基因刺激物（STING）上游的細(xì)胞質(zhì)DNA傳感的能力。TLR介導(dǎo)的核酸識別依賴存在于自身核酸中的分子模式。這表明免疫系統(tǒng)可以在正常情況下阻止自身核酸的刺激，但是在病理情況下，核酸敏感的PRR可以觸發(fā)先天性免疫激活。因此，由自身核酸引起的異常PRR激活具有驅(qū)動自身免疫誘導(dǎo)的風(fēng)險。

 

在這篇綜述中，研究者將討論免疫系統(tǒng)如何在內(nèi)體TLR水平上區(qū)分病毒核酸和自身核酸，以及在生理?xiàng)l件下，由TLR介導(dǎo)的自身核酸感應(yīng)驅(qū)動的預(yù)防自身免疫誘導(dǎo)的機(jī)制。一旦被募集到溶酶體區(qū)室，TLR在被駐留的pH依賴性蛋白酶切割后就具有功能活性。TLR到達(dá)溶酶體區(qū)室時被裂解，防止了其在細(xì)胞中其他位置定位，或在細(xì)胞表面上的自身核酸對核酸傳感TLR的活化，目前認(rèn)為，這是防止在生理?xiàng)l件下通過self-agonists對TLR異常活化的一種機(jī)制。但是，一旦TLR通過蛋白水解作用來發(fā)揮功能，它們就無法根據(jù)結(jié)構(gòu)差異區(qū)分病毒核酸和自身核酸，但TLR3除外。TLR3以不依賴序列的方式識別病毒dsRNA，通過感染細(xì)胞中存在的基因組dsRNA或dsRNA復(fù)制中間體的形式來識別病毒dsRNA。因此，病毒dsRNA代表一種真正的PAMP，可讓免疫系統(tǒng)區(qū)分病毒RNA和自身RNA分子。

 

圖2. 攝取病原體和死細(xì)胞的機(jī)制（Eva Brencicova and Sandra S. Diebold, 2013）

 

來自病原體和死細(xì)胞的物質(zhì)通過相同的攝取機(jī)制被細(xì)胞攝取，包括Fc受體、補(bǔ)體受體和清道夫受體介導(dǎo)的攝取。Fc受體和補(bǔ)體受體介導(dǎo)的攝取分別需要事先用抗體和補(bǔ)體因子進(jìn)行處理，抗原呈遞細(xì)胞（APC）活化受到物質(zhì)來源和吸收途徑的嚴(yán)格調(diào)節(jié)和影響。來自垂死的未感染細(xì)胞的物質(zhì)攝取又激活了許多調(diào)節(jié)途徑，這些調(diào)節(jié)途徑減弱了促炎性免疫原性APC的活化。相反，病原體或病原體來源物質(zhì)的攝取導(dǎo)致APC的促炎性免疫原性激活。也就是說，病毒入侵細(xì)胞，可以通過多種途徑來逃避被PRR劫持的風(fēng)險，而機(jī)體也進(jìn)化出了各種PRRs機(jī)制，使得宿主能夠有更好抗擊外來物的能力。從這個角度來說，機(jī)體免疫是一個動態(tài)的進(jìn)化過程，正確的識別可以幫助機(jī)體抗擊病毒，而錯誤的識別則會造成自身免疫性疾病等危害。

 

而新冠病毒是否來得及應(yīng)對機(jī)體PRRs的劫持，它的入侵會讓宿主啟動怎樣的自身保護(hù)機(jī)制呢？

 

新冠病毒感染后由PRRs介導(dǎo)的免疫應(yīng)答

研究者在一項(xiàng)回顧性的研究中發(fā)現(xiàn)，新冠肺炎重度患者總的T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，主要是介導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)的記憶T細(xì)胞，而這也從一定程度上增加了新冠肺炎痊愈患者復(fù)發(fā)的可能。從PRRs識別病毒的角度來說，新冠病毒感染激活的抗病毒應(yīng)答途徑分別是NF-κB，JAK/STAT：

 

1. NF-κB/TNFα信號通路

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是先天免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。一般條件下，NF-κB被抑制蛋白IκBs保留在細(xì)胞質(zhì)中。多種細(xì)胞刺激物，包括病原體，通過蛋白酶體誘導(dǎo)IκB磷酸化泛素化或降解，從而促進(jìn)NF-κB核易位。在細(xì)胞核中，NF-κB誘導(dǎo)廣泛的促炎因子、趨化因子、應(yīng)激反應(yīng)蛋白和抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄。NF-κB的活性對于病毒的存活和激活以及產(chǎn)生最佳免疫反應(yīng)至關(guān)重要。據(jù)報道，NF-κB活化的加劇與呼吸道病毒（包括SARS-CoV）誘導(dǎo)的肺炎性免疫病理有關(guān)。有研究者研究表明，在鼠巨噬細(xì)胞系（RAW264.7）中，暴露于病毒的重組S蛋白后，上清液中IL-6和TNF-α呈時間和濃度依賴性地大量釋放，IL-6和TNF-α分泌的增強(qiáng)，依賴于NF-κB的活化，而SARS-CoV-S蛋白與IκBα降解增加有關(guān)，這是激活NF-κB信號通路所需的必要步驟。因此，轉(zhuǎn)染具有抑制NF-κB活性的顯性失活因子NIK可以大大降低RAW264.7細(xì)胞中由S蛋白誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α的分泌，從而證明NF-κB是SARS-CoV-S 誘導(dǎo)IL-6和TNF-α分泌的必經(jīng)之路，體內(nèi)，通過抑制TNF-α的表達(dá)，用如caffeic acid phenethyl ester-CAPE、Bay 11-7082、parthenolide等藥物抑制NF-κB的活化，降低感染SARS-CoV小鼠肺部TNF-α、CXCL2、MCP-1的表達(dá)來減少炎癥。此外，研究者用藥物抑制NF-κB來保護(hù)病毒感染的小鼠肺部病理變化及存活率，實(shí)驗(yàn)證明感染SARS-CoV的老年獼猴肺部NF-κB活化增加了NF-κB核易位，并且發(fā)現(xiàn)年輕獼猴對病毒感染產(chǎn)生更強(qiáng)的宿主反應(yīng)，且顯著增加了NF-κB調(diào)節(jié)的促炎因子的表達(dá)。

 

圖3. SARS-CoV-2驅(qū)動的信號通路和潛在藥物靶標(biāo)的示意圖（Michele Catanzaro et al. 2020）

SARS-CoV-2感染誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路。將作用于這些途徑的選定藥物重新用于調(diào)控由該病毒感染引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴。

 

2. IL-6/JAK/STAT信號通路：

JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要激活劑之一是細(xì)胞因子IL-6，而在COVID-19患者中細(xì)胞因子IL-6顯著增加，伴隨著急性炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生。據(jù)報道，IL-6可以激活大量細(xì)胞來表達(dá)糖蛋白（gp-130）受體和結(jié)合IL-6的膜受體，可溶性的IL-6受體與gp130相互作用，從而促進(jìn)下游JAK/STAT信號通路的激活。IL-6是由多種組織產(chǎn)生的，包括活化的巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，在這些組織中IL-6分泌可以刺激巨噬細(xì)胞分泌MCP-1并促進(jìn)動脈粥樣硬化，增加細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。因此，IL-6的異常升高可能涉及到COVID-19部分患者中觀察到的心血管疾病（例如冠狀動脈粥樣硬化、血管系統(tǒng)炎癥導(dǎo)致彌散性微血管病和血栓形成）的發(fā)生。目前已經(jīng)證明，IL-6的合成和分泌是由血管緊張素II誘導(dǎo)的，而血管緊張素II是以JAK/STAT依賴的方式在發(fā)炎的血管中局部產(chǎn)生。SARS-CoV-2可能下調(diào)ACE2受體，導(dǎo)致血管緊張素II的過量產(chǎn)生，進(jìn)而以AT1/JAK/STAT依賴的方式增強(qiáng)IL-6的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致血管炎癥和肺損傷等COVID-19感染的臨床癥狀。血管緊張素II/AT1受體也激活NF-κB和ADAM17，而ACE2也是ADAM17的重要底物，據(jù)報道ACE2會被ADAM17切割而失活，而增強(qiáng)了血管緊張素II的存在，導(dǎo)致高血壓、心血管等病理生理的發(fā)生。ADAM17除了對ACE2受體脫落有影響外，它也是病毒進(jìn)入細(xì)胞的基礎(chǔ)，ADAM17誘導(dǎo)可將IL-6受體α（IL-6Rα）的膜形式加工成可溶性形式（sIL-6Rα），隨后gp130在多種IL-6Rα陰性非免疫細(xì)胞中通過sIL-6Rα-IL-6復(fù)合物介導(dǎo)STAT3活化，而STAT3的激活是需要由NF-κB通路的誘導(dǎo)。因此，SARS-CoV-2感染可能同時激活NF-κB和STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)STAT3過度激活NF-κB，從而放大IL-6效應(yīng)，誘發(fā)多種炎癥和自身免疫性疾病。

 

圖4. SARS-CoV-2在IL-6和血管緊張素II之間建立炎癥反饋回路的假設(shè)機(jī)制（Michele Catanzaro et al. 2020）

 

總結(jié)

PRRs對外來病原體PAMP、機(jī)體自身產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或病理代謝產(chǎn)物的損傷相關(guān)模式分子（DAMP）進(jìn)行識別取樣，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)程序，導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子和趨化因子等介質(zhì)產(chǎn)生，從而引起機(jī)體免疫反應(yīng)。我們通過對PRRs的介紹，分析了PRRs與病毒PAMP之間的關(guān)聯(lián)，并且回歸到目前的新冠疫情，可以從免疫學(xué)的角度更深度的審視新冠病毒給機(jī)體造成的損傷機(jī)制，病毒變異株傳染性和感染力的增強(qiáng)對我們研發(fā)疫苗提出了更多的挑戰(zhàn)，如果我們可以將視野擴(kuò)展到模式識別受體，是否會讓疫苗和藥物的研發(fā)擁有更新的思路呢？

 

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