在哺乳動物胚胎發(fā)育的過程中，多能細(xì)胞迅速分裂分化，但是每個器官細(xì)胞譜系的調(diào)控程序仍不清楚。近日，中科院動物研究所劉峰課題組與劍橋大學(xué)、加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員在《Nature Cell Biology》雜志上合作發(fā)表了題為“Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis”的文章，利用單細(xì)胞染色質(zhì)圖譜分析技術(shù)，對哺乳動物器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制有了新的認(rèn)識。

 

E8.25小鼠胚胎的單核染色質(zhì)圖譜

對于小鼠而言，8天左右的胚胎日齡是細(xì)胞類型多樣化的關(guān)鍵時期，因為大多數(shù)主要器官的前體細(xì)胞已經(jīng)形成。不過，由于早期胚胎中的細(xì)胞數(shù)量很有限，也缺乏標(biāo)志物蛋白來區(qū)分各種細(xì)胞，人們很難對其進(jìn)行分析。近期出現(xiàn)的單細(xì)胞分子圖譜繪制技術(shù)，終于讓人們有機(jī)會對早期器官發(fā)生時的細(xì)胞復(fù)雜性有了全面的認(rèn)識。

 

在這項研究中，研究人員首先利用單核ATAC-seq技術(shù)，繪制了來自10個小鼠胚胎（E8.25）的19,453個單細(xì)胞核的染色質(zhì)開放性圖譜（圖1a）。他們合并所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行peak calling，以此來定義開放的染色質(zhì)區(qū)域（OCR），并將峰的列表與已知的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）合并來鑒定稀有的細(xì)胞群。

 

通過這種方式，他們生成了18個細(xì)胞群，覆蓋三個胚層和胚胎外組織（圖1b）。為了進(jìn)一步評估數(shù)據(jù)質(zhì)量，他們研究了α-珠蛋白基因簇，該簇由胚胎（Hba-x）和成體（Hba-a1和Hba-a2）珠蛋白基因組成，其上游增強(qiáng)子（R1–R4和Rm）的特征明確。他們發(fā)現(xiàn)，僅紅系細(xì)胞簇的增強(qiáng)子可開放（圖1c），也只有胚胎Hba-x基因處于開放染色質(zhì)中，與成體基因形成鮮明對比。

圖1. 早期小鼠器官發(fā)生的單細(xì)胞染色質(zhì)圖譜

 

細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜

接下來，研究人員定義了細(xì)胞類型特異性的染色質(zhì)，用于鑒定常見的生物學(xué)過程。他們以19,453個細(xì)胞核作為變量，利用其開放性差異來觀察305,187個基因組區(qū)域。圖譜顯示了細(xì)胞特異性的開放染色質(zhì)區(qū)域在不同部位的分離（圖2a）。

 

同時他們還發(fā)現(xiàn)，相同胚層特有的開放染色質(zhì)區(qū)域是相鄰的，而神經(jīng)中胚層前體細(xì)胞（NMP）的開放染色質(zhì)區(qū)域位于脊髓和體壁中胚層之間，因此反映了發(fā)育譜系的關(guān)系。細(xì)胞特異性的開放染色質(zhì)區(qū)域主要位于基因間和內(nèi)含子，而那些普遍存在的區(qū)域（在超過25%的細(xì)胞核中存在）則大多與啟動子重合（圖2b）。

圖2. 細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜

 

兩個TAL1結(jié)合的內(nèi)皮增強(qiáng)子

成長中的小鼠胚胎嚴(yán)重依賴于早期循環(huán)系統(tǒng)的建立，以獲得充足的氧氣。血液和內(nèi)皮的發(fā)育通過共同的前體細(xì)胞、標(biāo)記基因、調(diào)控信號和蛋白密切關(guān)聯(lián)。在早期的小鼠胚胎中，第一波的原始血細(xì)胞大概是在E7.5從中胚層前體中產(chǎn)生的，瞬時表達(dá)與內(nèi)皮相關(guān)的基因。隨后，在E8.25左右，第二波得原始血細(xì)胞是從形成的內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生。

 

為了評估一些內(nèi)皮細(xì)胞如何向血液轉(zhuǎn)化，而其他內(nèi)皮細(xì)胞如何從尿囊中產(chǎn)生，研究人員重新評估了標(biāo)注為尿囊、紅系和內(nèi)皮的開放性圖譜。通過UMAP分析，他們觀察到一系列內(nèi)皮細(xì)胞向血液轉(zhuǎn)化，表明它們具有造血性質(zhì)。同時，他們還檢測到一組可能從尿囊中轉(zhuǎn)化而來的內(nèi)皮細(xì)胞，與之前發(fā)表的文獻(xiàn)一致。

 

鑒于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TAL1能破壞first and second blood waves，研究人員接著探索了TAL1結(jié)合與染色質(zhì)開放性有何關(guān)聯(lián)。通過數(shù)據(jù)分析，他們不僅鑒定出先前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮增強(qiáng)子Erg+85 kb和Fli1−15 kb，還發(fā)現(xiàn)了位于Flt1和Maml3基因的候選增強(qiáng)子（分別為Flt1+67 kb和Maml3+360 kb）（圖3）。轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎（由賽業(yè)生物提供）實驗表明，E11.5小鼠脈管系統(tǒng)中的兩種候選增強(qiáng)子均具有活性，這也顯示了細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜有助于鑒定組織特異性的調(diào)控區(qū)域。

圖3. Flt1+67 kb和Maml3+360 kb是兩個內(nèi)皮特異性的增強(qiáng)子

 

Fev參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成

正如前文所述，尿囊細(xì)胞可以在E8.25轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞。于是，研究人員便利用這種分化過程來研究胚胎發(fā)育過程中與內(nèi)皮細(xì)胞建立相關(guān)的調(diào)控程序。他們發(fā)現(xiàn)，ETS轉(zhuǎn)錄因子Fev和Etv2聚集在一起，在每個軌跡的中間都有一個特定的表達(dá)峰，表明它在胚胎內(nèi)皮的建立過程中發(fā)揮潛在作用。

 

于是，他們在斑馬魚中開展了體內(nèi)研究。他們將fev mRNA注入1-2個細(xì)胞階段的斑馬魚野生型胚胎中以評估fev過表達(dá)的作用。他們發(fā)現(xiàn)，這導(dǎo)致斑馬魚10體節(jié)期（10s）的lmo2和tal1上調(diào)以及受精后26小時（26 hpf）的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物flk1上調(diào)，而原始造血標(biāo)志物gata1a沒有上調(diào)，這支持了fev在賦予內(nèi)皮特性上的作用。之后的一系列分析也表明，fev為血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育最初階段的調(diào)控因子。

 

作者認(rèn)為，在小鼠和斑馬魚中開展的體內(nèi)驗證實驗結(jié)果一致，表明單細(xì)胞開放染色質(zhì)圖譜有助于人們了解哺乳動物器官發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制，這對于干細(xì)胞研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

 

原文檢索：

Pijuan-Sala, B., Wilson, N.K., Xia, J. et al. Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis. Nat Cell Biol 22, 487–497 (2020).

DOI：https://doi.org/10.1038/s41556-020-0489-9.