全球新冠疫苗的研發(fā)，目前已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，多種技術(shù)方式制備的疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床II期。然而動(dòng)物模型的相對短缺，很大程度影響了現(xiàn)階段新冠疫苗的研發(fā)及臨床試驗(yàn)的進(jìn)程，我們需要更多地了解動(dòng)物模型的選擇、制備以及應(yīng)用等多方面的信息，來完善疫苗或抗病毒藥物的研發(fā)和生產(chǎn)步驟，為人類的生命安全和生存質(zhì)量提供保障。

 

SARS研究中的小鼠模型回顧

歷史總是驚人的相似，從SARS到MERS，所用到的動(dòng)物模型對我們現(xiàn)在選擇新冠病毒動(dòng)物模型都有著重要的借鑒意義。2016年美國國立衛(wèi)生研究院傳染病實(shí)驗(yàn)室Troy C Sutton和Kanta Subbarao教授發(fā)表綜述性文章，詳細(xì)論述了在研究冠狀病毒的過程中動(dòng)物模型的發(fā)展和應(yīng)用。從小鼠模型來看，研究者用BALB/c近交系小鼠從鼻腔滴入SARS-CoV進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠沒有出現(xiàn)體重減輕、肺部病理等臨床現(xiàn)象。用C57BL/6小鼠獲得了相似的結(jié)果，仍然缺乏臨床表型。在B6以及129SvEv背景條件下，缺乏NK細(xì)胞功能或者NK-T細(xì)胞的CD1-/-小鼠，和缺乏T和B淋巴細(xì)胞的RAG1-/-小鼠的病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)相似，且均未出現(xiàn)臨床疾病表型。B6背景的STAT1-/-小鼠在組織病理學(xué)檢查中顯示有自限性毛細(xì)支氣管炎和片狀間質(zhì)性肺炎。但是，在129SvEv背景的STAT1-/-小鼠中，表現(xiàn)出進(jìn)行性體重減輕和細(xì)支氣管炎，并發(fā)展為間質(zhì)性肺炎和縱隔炎。盡管小鼠顯示出感染和肺部疾病的跡象，但近交系小鼠未能準(zhǔn)確地再現(xiàn)在人類觀察到的彌漫性肺泡損傷、水腫、肺細(xì)胞壞死和透明膜形成。

 

為了模擬流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)的高齡所導(dǎo)致的死亡率增加現(xiàn)象，研究者開發(fā)了SARS-CoV的老年小鼠模型。在此模型中，BALB/c和B6小鼠在肺中表現(xiàn)出高水平的病毒復(fù)制，并且這兩種小鼠的體重均有減輕，成年BALB/c小鼠還表現(xiàn)出皮毛褶皺和脫水。所有試驗(yàn)觀察到，老年小鼠模型對病毒的反應(yīng)更接近人類所表現(xiàn)出的病毒感染表型，因此老年小鼠比年輕小鼠得到了更廣泛的應(yīng)用。

 

圖1. 轉(zhuǎn)基因ACE2小鼠模型構(gòu)建方案1

（參考文獻(xiàn)：Paul B. McCray, Jr. et al. 2007）

 

為建立SARS-CoV感染的致死小鼠模型，研究者們研發(fā)了表達(dá)人ACE2（hACE2）的轉(zhuǎn)基因小鼠。通常，轉(zhuǎn)基因小鼠的疾病嚴(yán)重程度與hACE2表達(dá)水平相關(guān)。在細(xì)胞角蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠在肺、肝、結(jié)腸和腎臟中具有高水平的ACE2 mRNA。當(dāng)這些小鼠接觸到SARS-CoV，從氣道上皮開始感染，逐漸擴(kuò)散到大腦，到第7天時(shí)死亡率達(dá)到100％。

 

圖2. 轉(zhuǎn)基因ACE2小鼠模型構(gòu)建方案2

（參考文獻(xiàn)：Chien-Te K. Tseng et al. 2007）

 

另一種hACE2模型，是在巨細(xì)胞病毒IE增強(qiáng)子的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)hACE2，產(chǎn)生了具有不同水平的hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。用SARS-CoV感染hACE2高表達(dá)的小鼠產(chǎn)生了嚴(yán)重的肺部和腦部感染，死亡率為100％。這類小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎，伴有肺外器官損害，因此可以相對準(zhǔn)確地模擬人類SARS-CoV感染的病理狀態(tài)。

 

以上研究表明，在小鼠ACE2啟動(dòng)子的控制下表達(dá)hACE2，可導(dǎo)致hACE2的組織分布受到限制。受到SARS-CoV攻擊的hACE2低表達(dá)的小鼠變得昏昏欲睡，但不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重感染致死。研究還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中觀察到病毒載量或病毒抗原有所增加，并且由于病毒在腦中的廣泛傳播導(dǎo)致死亡率增加，而人類臨床很少觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。因此，雖然轉(zhuǎn)基因小鼠提供了SARS-CoV感染的致死模型，但沒有小鼠模型能夠全面精確地復(fù)制SARS-CoV感染患者被病毒感染的整個(gè)進(jìn)程。

 

在不斷探索和驗(yàn)證SARS-CoV小鼠模型的過程中，我們發(fā)現(xiàn)基因編輯技術(shù)是小鼠模型發(fā)展的一個(gè)重要限制因素。隨著CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)和普及，人源化小鼠模型應(yīng)運(yùn)而生。這種模型可以實(shí)現(xiàn)基因在特定時(shí)間和位點(diǎn)的插入及表達(dá)，更精準(zhǔn)地模擬人類感染疾病的狀態(tài)，更清晰地認(rèn)識(shí)病毒與人類相互作用的方式和過程，這樣我們就能夠制備更合理的方案來應(yīng)對各種并不友善的“天外來賓”。

 

新冠病毒就是這樣一個(gè)不速之客，它與SARS-CoV有著非常相似的地方，因此以上小鼠模型對于研究新冠病毒具有非常重要的借鑒意義。科研人員在這些研究的基礎(chǔ)上運(yùn)用新技術(shù)對模型進(jìn)行更新和完善，構(gòu)建了不同類型的新冠小鼠模型。那么，這些新冠小鼠模型是如何構(gòu)建的呢？是否能準(zhǔn)確全面地模擬人體感染病毒的過程呢？

 

多種新冠小鼠模型的比較分析

新冠小鼠模型研發(fā)的基礎(chǔ)是基因編輯技術(shù)。所以我們需要進(jìn)一步探討，在目前基因編輯技術(shù)下所誕生的新冠小鼠模型是怎樣制備的？它們的應(yīng)用價(jià)值到底體現(xiàn)在哪里？

 

2020年6月5日，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京微生物與流行病學(xué)研究所病原與生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在《Cell Host & Microbe》發(fā)表了題為“A mouse model of SARS-CoV-2 infection and pathogenesis”的論文，該研究建立了一種新的hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過新冠病毒攻毒實(shí)驗(yàn)，成功模擬了病毒在人體內(nèi)的發(fā)病過程、病理特征和傳播方式。

 

圖3. hACE2人源化小鼠的構(gòu)建方案

（參考文獻(xiàn)：Shi-Hui Sun et al. 2020）

 

如上圖所示，打靶策略是將hACE2完整的cDNA插入位于X染色體GRCm38.p6位點(diǎn)的mACE2基因第二個(gè)外顯子處，這樣就破壞并終止了mACE2的表達(dá)。將tdTomato基因插入帶有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的hACE2下游，從而使hACE2和tdTomato共表達(dá)。添加了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（WPRE）和polyA序列，以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。該靶向策略允許hACE2的表達(dá)在mACE2啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行。將靶向構(gòu)建體連同亞基因組RNA（sgRNA）和Cas9 mRNA一起注入C57BL/6小鼠的受精卵中。

 

該小鼠模型采用CRISPR/Cas9敲入技術(shù)制備，將內(nèi)源性小鼠ACE2（mACE2）替換為人類ACE2（hACE2），與野生型C57BL/6小鼠相比，年輕和年老的hACE2小鼠在鼻內(nèi)感染后均在肺、氣管和腦中維持高病毒載量。盡管未觀察到死亡，但在新冠病毒感染的hACE2小鼠中發(fā)現(xiàn)了間質(zhì)性肺炎和細(xì)胞因子升高。有趣的是，該研究還發(fā)現(xiàn)，新冠病毒在hACE2小鼠胃內(nèi)接種也會(huì)引起感染并導(dǎo)致肺部病理改變，這為新冠病毒的感染和傳播提供了一個(gè)新的思路。

 

圖4. C57BL/6和BALB/c制備ACE2的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)新冠小鼠模型

（參考文獻(xiàn)：Jing Sun et al. 2020）

 

制備新冠小鼠模型除了轉(zhuǎn)基因的方式之外，還有用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)hACE2制備新冠模型小鼠的方法。2020年6月10日，廣州呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙金存教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合多家單位共同發(fā)表了利用腺病毒載體制備的新冠小鼠模型，如圖4所示，該研究通過復(fù)制缺陷型腺病毒（Ad5-hACE2）將外源hACE2通過鼻內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式遞送入C57BL/6和BALB/c兩種品系及相應(yīng)基因敲除的小鼠中，對小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，通過免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)檢測hACE2的表達(dá)。

 

研究觀察到hACE2主要在肺泡上皮中表達(dá)，偶爾在氣道上皮中有陽性細(xì)胞。感染新冠病毒的Ad5-hACE2轉(zhuǎn)導(dǎo)的BALB/c小鼠以及C57BL/6在感染2天后開始出現(xiàn)皮毛起皺、駝背和呼吸困難等癥狀，類似于SARS-CoV感染BALB/c小鼠。兩種小鼠品系的肺組織均顯示出多種損傷，包括血管周圍至間質(zhì)性炎性細(xì)胞浸潤、壞死細(xì)胞碎片和肺泡水腫。這些都表明，該方法制備的新冠小鼠模型對新冠病毒易感，能夠有效評估疫苗和藥物的療效。

 

圖5. 利用AdV-hACE2轉(zhuǎn)導(dǎo)的新冠小鼠模型制備中和抗體

（參考文獻(xiàn)：Ahmed O. Hassan et al. 2020）

 

華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)部研究團(tuán)隊(duì)用同樣的方法，利用AdV-hACE2鼻內(nèi)和靜脈轉(zhuǎn)導(dǎo)BALB/c小鼠制備新冠小鼠模型，結(jié)果表明，hACE2的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)使SARS-CoV-2感染BALB/c小鼠，并且能產(chǎn)生高效中和抗體。

 

賽業(yè)生物作為模式動(dòng)物領(lǐng)域發(fā)展的領(lǐng)先者，在新冠疫情爆發(fā)初期，便組織研發(fā)團(tuán)隊(duì)全力開發(fā)新冠小鼠模型。我們利用自主研發(fā)的TurboKnockout技術(shù)和經(jīng)過優(yōu)化的CRISPR-Pro技術(shù)同步開展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三種背景品系的人源化小鼠制備，并綜合考慮不同基因編輯方式的優(yōu)缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)了多種基因打靶方案，以滿足不同研究目的和不同應(yīng)用方向的需求。

 

新冠疫情發(fā)生到現(xiàn)在已經(jīng)有半年時(shí)間，而疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)逐漸明朗，雖然不能馬上用于感染者進(jìn)行預(yù)防和治療，但抗疫取得了階段性的勝利是有目共睹的。在這個(gè)過程中，小鼠成了人類抗疫路上的偉大助手，實(shí)現(xiàn)了它對人類的最大價(jià)值。人類共同命運(yùn)，生物和諧生存，愿我們擁有一個(gè)更美好的地球家園。

 

參考文獻(xiàn)：

1、Troy C Sutton and Kanta Subbarao. Development of Animal Models Against Emerging Coronaviruses: From SARS to MERS coronavirus. Virology. 2015

2、Paul B. McCray, Jr., Lecia Pewe, Christine Wohlford-Lenane et al. Lethal Infection of K18-hACE2 Mice Infected with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Journal of virology. 2007

3、Tseng CT, Huang C, Newman P et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus infection of mice transgenic for the human Angiotensin-converting enzyme 2 virus receptor. Journal of virology. 2007

4、Chien-Te K. Tseng, Cheng Huang, Patrick Newman et al. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infection of Mice Transgenic for the Human Angiotensin-Converting Enzyme 2 Virus Receptor. Journal of virology. 2007

5、Shi-Hui Sun, Qi Chen, Hong-Jing Gu et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host & Microbe. 2020

6、Jing Sun, Zhen Zhuang, Jian Zheng et al. Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19 Pathogenesis Vaccination, and Treatment. Cell. 2020

7、Roberts, A., Deming, D., Paddock, C.D. et al. A mouse-adapted SARS-coronavirus causes disease and mortality in BALB/c mice. PLoS Pathog. 2007

8、Ahmed O. Hassan, James Brett Case, Emma S. Winkler et al. A SARS-CoV-2 infection model in mice demonstrates protection by neutralizing antibodies. Cell. 2020