隨著多年來對AD研究的深入，我們已經(jīng)了解到AD有兩大病例特征，即患者腦中會存在大量由Aβ（Amyloid Beta）聚集而成的淀粉樣沉淀和由tau聚集而成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，其中Aβ由APP（Amyloid Precursor Protein）經(jīng)過兩次剪切而成：非淀粉樣蛋白剪切和淀粉樣蛋白剪切。前者可以理解為不產(chǎn)生毒性Aβ的“好的”剪切方式，后者過度活躍則會造成Aβ過載，產(chǎn)生淀粉樣沉淀。這兩種剪切都需要兩把“剪刀”，區(qū)別在于第一把“剪刀”的不同，前者第一刀是α-secretase（α剪切酶）動的手，因為α剪切酶幾乎是從APP的Aβ片段中間攔腰剪斷的，所以Aβ——卒！但要注意的是，這種剪切之后APP就裂開了，形成了N端的APPSα（也可以寫成sAPPα）和C端的α-CTF，可以簡單地理解成，這兩個片段越多，說明APP的剪切越趨近于“良性”，越不容易產(chǎn)生Aβ。至于α-CTF的進(jìn)一步剪切，我們暫時不用管它。

 

如果是淀粉樣蛋白剪切，那就是β-secretase（β剪切酶）開始動的手。這一刀剪在Aβ序列的N端，APP就分成了APPSβ（也可以寫成sAPPβ）和C端的β-CTF，剛才說到的Swe突變就會導(dǎo)致APP的β剪切更容易發(fā)生。這些帶“β”家伙的出現(xiàn)往往就意味著Aβ含量的增加，因為β-CTF再被γ剪切酶剪切后“大魔王”Aβ就正式出場了。

圖1. APP剪切過程

 

這里順道提一下，γ剪切酶與α和β剪切酶不一樣，后面兩個刀法精準(zhǔn)，剪切位置固定；而γ則對α-CTF或者β-CTF的剪切飄忽不定，所以Aβ指的是一類短肽（36-43個氨基酸都有可能），而不是固定大小的片段，總體而言Aβ越長，越容易聚集，毒性也就越大。

 

 

因為只有人類和一些靈長類動物的Aβ片段是容易發(fā)生聚集的，如果不將Aβ片段人源化，即使在嚙齒類動物中引入再多的突變，也很難產(chǎn)生Aβ聚集物，從而影響造模效果，因此構(gòu)建大鼠模型需要將Aβ片段人源化。接著對Aβ人源化了的大鼠進(jìn)行突變，接下來為大家介紹3種Aβ人源化突變大鼠。

 

Luciano D’Adamio實驗室發(fā)表了三種AD基因編輯大鼠，這三種大鼠均采用基因敲入（Knock-In）的方法。有人可能會問，為什么選用KI而非傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因（Transgenic，Tg）的方式呢，這一方面是由于過往采用轉(zhuǎn)基因方式的研究沒有產(chǎn)出一款A(yù)D治療藥物（基于Aβ假說）；另一方面KI相較于Tg有以下三大優(yōu)勢：

1. 和Tg相比，KI沒有隨機插入，對大鼠本身基因的影響控制到了最低水平；

2. 沒有多拷貝，更接近人類疾病中的病理特征；

3. 保留了大部分大鼠基因的原有序列，使得大鼠原有的調(diào)控原件仍能發(fā)揮作用。

圖2. 三種APP基因編輯大鼠

 

作者分別對Aβ人源化了的大鼠進(jìn)行了兩種突變，一種是常見的Swe突變，即K670N/M671L突變，這種突變會造成家族性AD的發(fā)生，使病患產(chǎn)生認(rèn)知障礙；而另一種則是A673T突變，這種突變會對AD產(chǎn)生的認(rèn)知障礙有一定的保護作用。

 

Luciano D’Adamio實驗室制作了PS1突變敲入的大鼠，同時具有人源化的Aβ序列和L435F的純合突變。

圖3. PS1的L435F突變位點

 

Aβ人源化＋A673T突變大鼠

先來解釋下圖中的各種大鼠的名稱，w/w是野生型，δ7/δ7是刪除了7個堿基片段的APP，h/h是人源化Aβ純合，s/s是在人源化基礎(chǔ)上進(jìn)行swe突變純合子，p/p是在人源化基礎(chǔ)上A673T突變純合子。在第21天時，三種人源化大鼠的APP表達(dá)沒有改變。

 

而p/p的sAPPα水平卻明顯高于h/h，而sAPPβ則低于h/h，這說明大鼠的A673T突變抑制了β剪切酶的剪切。同時，β-CTF也相應(yīng)減少。這說明A673T突變在該大鼠21日齡時在APP的剪切層面具有一定的保護作用，也就是抑制β剪切酶對APP進(jìn)行剪切。

圖4. A673T突變抑制β剪切酶的剪切作用

 

除了抑制β剪切酶的功能以外，理論上，由于β-CTF減少，Aβ的表達(dá)應(yīng)該也受到抑制，結(jié)果不出所料，28天的大鼠各種Aβ顯著降低，值得注意的是，這里的研究還對大鼠進(jìn)行了雌性區(qū)分，結(jié)果基本類似。WB對CTF的檢測得到的結(jié)果也與N端產(chǎn)物類似，這說明A673T突變能抑制Aβ的產(chǎn)生。比較有意思的是在Aβ38的檢測中，該Aβ只在雌性小鼠中存在。

圖5. A673T突變抑制Aβ生成

 

Aβ人源化＋swe突變大鼠

反過來，如果是APPswe大鼠，則會有明顯的β剪切和Aβ表達(dá)的增加，同時由于β剪切的加劇，成熟APP的含量也降低。因此該大鼠模型在APP剪切方面對AD進(jìn)行了有效的模擬。

 

總結(jié)起來就是保護性的A673T突變會降低β剪切，而swe突變會增加β剪切。前者最終降低Aβ，而后者則增加Aβ。

圖6. swe突變增加Aβ

 

Aβ人源化＋PS1突變大鼠

圖1中γ剪切酶由4種蛋白共同組成，其中最重要的組成元素就是早老素蛋白1（Presenlin1,PS1）了。Luciano D’Adamio實驗室制作了PS1突變敲入的大鼠。

 

該大鼠可以表達(dá)L435F突變，這與小鼠不同，如果小鼠含有這種PS1上的純合突變是致死的，無法進(jìn)行后續(xù)的實驗。而純合L435F大鼠雖然也會造成27天時體重的下降以及1月齡時40%的死亡率，但挺過一個月的大鼠活到2月齡基本沒有問題，所以L435F純合大鼠是可以進(jìn)行實驗的。此外438位點的突變是同義突變，對氨基酸序列沒有影響。

圖7 . PS1純合突變降低大鼠體重和生存率

 

有意思的是，大鼠出生4天后就會造成Aβ38、Aβ40和Aβ42的降低，但卻會造成Aβ43的增加。同時高分子量Aβ與低分子量Aβ之比也會隨著突變的影響而增大，因此這個結(jié)果說明PS1-L435F KI降低了γ剪切酶的整體剪切能力，但提升了對Aβ43的剪切。Aβ的毒性不僅與Aβ的豐度有關(guān)，也與不同Aβ之間的比值相關(guān)，因此這個結(jié)論究竟對Aβ的毒性有怎樣的影響，還有待于進(jìn)一步研究；另一方面，由于使用的大鼠剛出生4天，所以隨著年齡的增加γ剪切酶的功能會不會發(fā)生改變還猶未可知。

圖8. PS1的L435F突變增加Aβ43

 

綜上，其實我們已經(jīng)有了具有AD病理特征的大鼠KI模型，而且隨著基因編輯技術(shù)在大鼠中的應(yīng)用愈發(fā)成熟，我們也可以將人的更多突變引入到大鼠中，從而模擬人的AD病理表型。目前AD大鼠模型的數(shù)量相對而言還很少，但大鼠在AD研究甚至神經(jīng)生物學(xué)研究中的優(yōu)勢讓人不得不重新對其重視起來。

 

不過稍微讓人感到遺憾的是，由于上面提到的AD大鼠模型在進(jìn)行病理實驗時年齡還太�。ㄗ畲蟮膶嶒�?zāi)挲g也才28天，最小才4天），因此很多分子層面的改變可能需要時間的積累才能發(fā)生。此外，神經(jīng)生物學(xué)中最重要的行為表型也需要在一定年齡后進(jìn)行檢測，這將是模型優(yōu)劣的關(guān)鍵。因此十分期待后續(xù)的行為研究能有不錯的結(jié)果。

 

由于大鼠相對小鼠更為聰明，行為實驗中的分辨率會進(jìn)一步提高，我們已有的分子和病理層面的改變更容易反應(yīng)到行為上來。

 

此外在已經(jīng)構(gòu)建了不同基因編輯模型的情況下，如果將這些大鼠進(jìn)行雜交，也可以獲得如Tg小鼠的多基因編輯大鼠，從而有利于我們獲得更明顯的病理表型。因此大鼠模型的建立，開發(fā)和優(yōu)化將為AD的研究，尤其是藥物開發(fā)研究提供有力的武器。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Tambini M D , D'Adamio L . Knock-in rats with homozygous PSEN1 L435F Alzheimer mutation are viable and show selective γ-secretase activity loss causing low Aβ40/42, high Aβ43[J]. Journal of Biological Chemistry, 2020:jbc.RA120.012542.

2. Tambini M D , Norris K A , D'Adamio L . Opposite changes in APP processing and human Aβ levels in rats carrying either a protective or a pathogenic APP mutation[J]. eLife Sciences, 2020, 9.