在全國疫情逐步清零時，北京的疫情卻出現(xiàn)了“反彈”，牽動著全國人民的心。截止6月18日24時，北京8天內(nèi)已出現(xiàn)新增確診病例183例，還有一些主動篩查中發(fā)現(xiàn)的無癥狀攜帶病例。這無疑在告訴我們每一個人：疫情尚未結(jié)束，仍需加強(qiáng)防疫！

對于中國乃至整個世界來說，由新冠病毒（SARS-CoV-2) 引起的全球新冠肺炎（COVID-19）大流行疫情，都是一個巨大的挑戰(zhàn)。深入研究嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（SARS）與宿主分子相互作用機(jī)制，探討病毒致病過程，建立SARS病毒感染疾病模型，對于指導(dǎo)臨床治療、疫苗和藥物研發(fā)，都具有非常重要的意義。不論是疫苗研發(fā)還是新藥研發(fā)，以及基因治療，均需要精準(zhǔn)的動物模型來驗(yàn)證疾病的發(fā)病和免疫機(jī)制。

一、應(yīng)用小鼠模型研究SARS的意義與優(yōu)勢？

在研究人病毒感染性疾病中，小鼠模型優(yōu)勢是非常明顯的，比如，成本較低、容易繁殖飼養(yǎng)、繁殖較快和產(chǎn)仔數(shù)較多。更重要的是，近交系小鼠的遺傳背景具有一致性，在此基礎(chǔ)上，可對小鼠基因進(jìn)行相應(yīng)的編輯改造建立需要的模型，這都無疑有助于研究宿主特定基因在病毒致病過程中的影響作用，也有利于深入了解病毒或疫苗引起的宿主免疫系統(tǒng)反應(yīng)及其免疫保護(hù)作用。

當(dāng)然，小鼠模型也存在局限性。由于病毒感染人體或小鼠細(xì)胞，常常是通過與宿主體內(nèi)特殊的細(xì)胞表面受體結(jié)合，與宿主的先天免疫反應(yīng)等因素有關(guān)，而且，小鼠與人之間的存在一定的物種差異性，導(dǎo)致一些人病毒無法直接感染小鼠，或人病毒雖能在小鼠體內(nèi)復(fù)制，但卻難以引起感染疾病明顯的癥狀表現(xiàn)。所以，將小鼠模型研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為人體時，需要謹(jǐn)慎小心。但是，利用各種類型的基因編輯小鼠、人源化小鼠、或者遺傳多樣性的小鼠品系等，從某種程度上可以克服野生型小鼠的短處，使小鼠模型成為研究宿主與病毒致病相互作用，評價疫苗與藥物安全性及有效性的非常有用的研究工具。

二、應(yīng)用小鼠模型研究SARS-CoV有哪些策略與方法？ 

根據(jù)小鼠構(gòu)建策略與方法不同，目前SARS-CoV感染小鼠模型分為三種：

1.應(yīng)用人SARS-CoV病毒直接感染近交系小鼠；

2.應(yīng)用基因編輯小鼠技術(shù)，敲除小鼠相關(guān)基因，或?qū)⑷怂拗骷?xì)胞SARS病毒結(jié)合受體（比如ACE2）轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)；

3.將野生型SARS-CoV病毒在小鼠體內(nèi)進(jìn)行反復(fù)適應(yīng)進(jìn)化過程，獲得致病性更強(qiáng)的小鼠適應(yīng)病毒，從而建立能引起明顯臨床表型的病毒感染小鼠模型。

關(guān)于SARS-CoV感染小鼠模型，主要的研究進(jìn)展集中于以下幾個方面： 

（1）直接應(yīng)用近交系小鼠模型研究SARS病毒致病性

由于SARS-CoV感染人群造成病死率的增加，與年紀(jì)較大的患者（大于60歲）發(fā)生嚴(yán)重急性呼吸道困難綜合癥（ARDS）的增加有關(guān)，為了探討能模擬老年人感染SARS-CoV更適合的小鼠模型，有研究分別應(yīng)用12-14月大的BALB/c、C57BL/6和129S6近交系野生小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此三種老年小鼠經(jīng)SARS-CoV感染后，都有短暫（平均約7天左右）的臨床癥狀表型，比如體重減少、亂的毛發(fā)、弓背和脫水等，更為重要的是，在組織病理學(xué)方面，表現(xiàn)有血管周圍和細(xì)支氣管周圍炎性細(xì)胞滲入，細(xì)支氣管細(xì)胞壞死，以及間質(zhì)性肺炎發(fā)生等現(xiàn)象。而且，BALB/c小鼠的廣泛肺泡破壞可持續(xù)到第9天，非常接近人SARS-CoV感染的臨床病理癥狀。該研究也是第一次闡明了不同宿主遺傳及年齡特征，可以顯著影響SARS-CoV感染致病性強(qiáng)弱，同時也再次表明，病毒感染性疾病的發(fā)生，不僅與病毒本身特性有關(guān)，宿主自身相關(guān)因素也發(fā)揮極為重要的作用。

（2） 應(yīng)用基因編輯技術(shù)建立SARS病毒感染小鼠模型 

關(guān)于hACE2遺傳修飾人源化小鼠模型的構(gòu)建策略，目前通常應(yīng)用不同的組織特異性或廣泛表達(dá)啟動子與hACE2基因構(gòu)建的表達(dá)載體，通過原核注射的方法，獲得隨機(jī)插入的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，比如，細(xì)胞角蛋白（上皮細(xì)胞特異性表達(dá)-K18）啟動子；CAG啟動子（廣泛表達(dá)）或小鼠ACE2基因啟動子。應(yīng)用這些ACE2人源化小鼠模型的研究結(jié)果表明，hACE2的表達(dá)水平高低與其疾病的嚴(yán)重程度直接相關(guān)。雖然，這些小鼠模型都表現(xiàn)有呼吸道上皮細(xì)胞感染，但同時在小鼠腦部也可見高表達(dá)的hACE2基因，并在SARS-CoV感染模型中發(fā)現(xiàn)，病毒量在小鼠腦部的增加與廣泛擴(kuò)散，最終導(dǎo)致小鼠發(fā)生腦炎而死亡。

（3）應(yīng)用適應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)化方式獲得SARS-CoV變異強(qiáng)毒株 

通過將病毒種植在小鼠特異性組織中，進(jìn)行適應(yīng)進(jìn)化，迫使病毒適應(yīng)其特定生存環(huán)境，并在特定的選擇壓力下發(fā)生突變，以達(dá)到更有利于其有效復(fù)制的目的。為了讓SARS-CoV適應(yīng)在野生小鼠肺部復(fù)制，并引起嚴(yán)重急性呼吸道疾病表型，研究者通過對BALB/c小鼠（6周齡）鼻腔反復(fù)接種SARS-CoV臨床株15次,直到野生小鼠出現(xiàn)明顯的人感染SARS-CoV的臨床癥狀（比如體重下降等）。通過比較不同傳代獲得的適應(yīng)致死病毒株，有助于分析病毒引起嚴(yán)重呼吸道致病毒力的變化與其蛋白特定突變間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步研究特異性SARS-CoV蛋白適應(yīng)性突變在病毒宿主間作用聯(lián)系提供了方便。

（4）應(yīng)用協(xié)同交配（Collaboratory Cross-CC）技術(shù)建立遺傳背景多樣性小鼠品系

應(yīng)用CC小鼠品系建立SARS-CoV感染模型，有助于尋找在病毒致病過程中，是哪些遺傳相關(guān)影響因素，決定了宿主對病毒感染性疾病的不同反應(yīng)。通過用SARS-CoV感染CC小鼠后，分析比較不同表型的CC品系小鼠，比如體重減少的高與低，或病毒滴度的高與低等，達(dá)到快速確定與表型相關(guān)基因的目的。利用CC小鼠技術(shù)，有研究者從SARS-CoV感染致病過程中，尋找到對病毒敏感性完全相反的CC小鼠品系（CC003和CC053/Unc)，基因定位分析發(fā)現(xiàn)，在Toll樣受體信號通路中的適配體蛋白Ticam2，是決定嚴(yán)重呼吸道疾病表型的潛在關(guān)鍵因子�；�于這類研究的結(jié)果表明，CC小鼠可作為更加客觀模擬人病毒感染疾病臨床表型的一種新型小鼠模型。

三、小鼠模型在新冠病毒（SARS-CoV-2）研究中的應(yīng)用進(jìn)展

無論是核酸還是氨基酸序列比較分析都證實(shí)，SARS-CoV-2與SARS-CoV的相似性非常高 （分別約為80%和76%），而且SARS-CoV-2也是通過細(xì)胞表面的ACE2受體與宿主發(fā)生相互作用，引起與SARS-CoV感染相似（雖然不是完全相同）的嚴(yán)重急性呼吸道困難綜合癥等臨床表現(xiàn)。因此，上面介紹的針對SARS-CoV感染的相關(guān)小鼠模型構(gòu)建策略與方法，也適合于SARS-CoV-2感染小鼠模型的建立。 目前小鼠模型在新冠病毒感染研究中的最新應(yīng)用研究都是由中國科學(xué)家們完成。

1. 轉(zhuǎn)基因人源化ACE2小鼠模型

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所秦川主導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)全球首先報道建立新冠病毒感染hACE2小鼠模型，該轉(zhuǎn)基因hACE2小鼠模型是應(yīng)用小鼠mAce2啟動子和hACE2基因構(gòu)建的表達(dá)載體，通過原核注射方法獲得動轉(zhuǎn)基因hACE2小鼠模型。hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠受到SARS-CoV-2病毒感染后，小鼠會出現(xiàn)了體重下降，小鼠肺部可檢測到高水平的病毒載量，且病毒感染小鼠出現(xiàn)中度間質(zhì)性肺炎，肺泡間質(zhì)中大量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集等病理學(xué)特征。

另外，研究者們還首次應(yīng)用該hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠對新冠病毒滅活疫的安全性與有效性進(jìn)行了評價。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量和不同時間的滅活疫苗免疫h(yuǎn)ACE2小鼠，未觀察到小鼠出現(xiàn)炎癥和不良反應(yīng)。檢測分析滅活疫苗的免疫原性顯示，小鼠體內(nèi)可被誘導(dǎo)產(chǎn)生針對SARS-CoV-2的S蛋白和RBD特異性的IgG，且針對RBD特異性的IgG占S蛋白抗體反應(yīng)高達(dá)50%，提示RBD是新冠病毒滅活疫苗的主要免疫原。

2. 定點(diǎn)插入人源化hACE2小鼠模型

中檢院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所主導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)首次報道成功構(gòu)建定點(diǎn)插入hACE2-KI/NIFDC小鼠模型。該人源化小鼠構(gòu)建策略是將hACE2基因定點(diǎn)插入小鼠mAce2基因啟動子之下，并將tdTomato基因插入到hACE2基因的下游，使該人源化小鼠在內(nèi)源性mAce2基因的調(diào)控下，共表達(dá)hACE2和tdTomato基因。SARS-CoV-2病毒經(jīng)鼻感染青年和老年hACE2小鼠感染后，小鼠的肺、氣管和腦中均出現(xiàn)較高的病毒載量，而在小鼠脾、腎、肝、腸和血清中沒有發(fā)現(xiàn)病毒RNA。青年和老年hACE2小鼠均發(fā)生了間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增厚和明顯的血管系統(tǒng)損傷。但未見感染小鼠死亡。分析SARS-CoV-2感染小鼠的主要靶細(xì)胞表明，Clara細(xì)胞分泌蛋白（CC10）陽性Clara細(xì)胞是SARS-CoV-2在氣道中的主要靶細(xì)胞。

研究還證實(shí)，胃內(nèi)接種SARS-CoV-2也可引起hACE2小鼠感染，并導(dǎo)致hACE2小鼠發(fā)生肺部病理變化。

3. 腺病毒載體制備的小鼠模型

廣州呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙金存教授團(tuán)隊(duì)利用腺病毒載體（Ad5) ， 在小鼠肺臟轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)hACE2，成功建立全球首個非轉(zhuǎn)基因新冠肺炎小鼠模型。

通過構(gòu)建CMV啟動子表達(dá)hACE2基因的腺病毒（Ad5） 載體(Ad5-CMV-hACE2), 分別經(jīng)鼻內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，在野生小鼠和相關(guān)基因敲除小鼠（I型干擾素受體缺陷小鼠或干擾素通路關(guān)鍵基因STAT1敲除小鼠）基礎(chǔ)上，建立小鼠肺部表達(dá)hACE2基因的小鼠模型。

該種非轉(zhuǎn)基因人源化hACE2小鼠經(jīng)SARS-CoV-2感染后，小鼠肺部可檢測到高滴度病毒，并出現(xiàn)體重下降和類似新冠肺炎病人的臨床病理表現(xiàn)。同時，該小鼠模型實(shí)驗(yàn)也證明，I型干擾素和STAT1基因具有潛在抗SARS-CoV-2感染的保護(hù)作用。

賽業(yè)生物作為模式動物領(lǐng)域發(fā)展的領(lǐng)先者，在新冠肺炎疫情爆發(fā)初期，便組織研發(fā)團(tuán)隊(duì)全力開發(fā)新冠小鼠模型。我們利用自主研發(fā)的TurboKnockout技術(shù)和經(jīng)過優(yōu)化的CRISPR-Pro技術(shù)同步開展BALB/c、C57BL/6J、C57BL/6N三種背景品系的人源化hACE2小鼠制備，并綜合考慮不同基因編輯方式的優(yōu)缺點(diǎn)，設(shè)計了多種基因打靶方案與構(gòu)建策略，以滿足不同研究目的和不同應(yīng)用方向的需求。

新冠肺炎疫情發(fā)生到現(xiàn)在已經(jīng)有半年時間，而疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)逐漸明朗，雖然不能馬上用于感染者進(jìn)行預(yù)防和治療，但抗疫取得了階段性的勝利是有目共睹的。在這個過程中，小鼠成了人類抗病毒感染之路上的偉大助手，實(shí)現(xiàn)了它對人類的最大價值。人類共同命運(yùn)，生物和諧生存，愿我們擁有一個更美好的地球家園。

作者

俞曉峰 博士，高級科學(xué)家

俞曉峰博士現(xiàn)任賽業(yè)模式生物副總裁、高級科學(xué)家，負(fù)責(zé)基因修飾模式動物的研發(fā)與技術(shù)服務(wù)等工作。俞博士在遺傳基因模式動物領(lǐng)域有超過20年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，在干細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動物細(xì)胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology，Hum Mol Genet，Mol Cell Biol 等高水平雜志上。加入賽業(yè)生物前，俞博士2010-2013年任職于美國應(yīng)用干細(xì)胞（ASC）公司，擔(dān)任研發(fā)總監(jiān)，負(fù)責(zé)基因修飾模式動物的研發(fā)與定制服務(wù)，并在中國子公司斯坦福生物科技擔(dān)任副總裁一職。2009-2010任紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。2003-2009期間任職于美國基因打靶公司（iTL），作為資深科學(xué)家和項(xiàng)目經(jīng)理負(fù)責(zé)參與了基因修飾小鼠模型研發(fā)方案與策略設(shè)計、項(xiàng)目管理、技術(shù)人員指導(dǎo)與培訓(xùn)、以及客戶服務(wù)和技術(shù)咨詢等方面工作，2007年起負(fù)責(zé)開發(fā)了p53基因不同點(diǎn)突變的人源化腫瘤小鼠模型庫項(xiàng)目。2000年任美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。1995年獲得軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位。