17年前，SARS冠狀病毒引起的“非典”事件，回想起來(lái)，仍讓人心有余悸。17年后，武漢又爆發(fā)了轟動(dòng)全球的新型冠狀病毒肺炎感染事件。1月12日，世界衛(wèi)生組織（WHO）正式將造成武漢肺炎疫情的新型冠狀病毒命名為2019-nCov。



2月8日下午，國(guó)務(wù)院應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制成員現(xiàn)決定，將新型冠狀病毒感染的肺炎暫命名為“新型冠狀病毒肺炎”，英文名為“Novel coronavirus pneumonia”，簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”，英文簡(jiǎn)稱NCP。

2月11日晚，國(guó)際病毒分類委員會(huì)的冠狀病毒研究小組（CSG）在醫(yī)學(xué)類預(yù)印本發(fā)布平臺(tái) medRxiv 發(fā)表最新關(guān)于新型冠狀病毒命名的論文，宣布新型冠病毒“2019-CoV”的正式分類名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。另外，在該篇論文發(fā)布前兩個(gè)小時(shí)，世界衛(wèi)生組織（WHO）也將由新型冠狀病毒所致的疾病，正式命名為“COVID-19”。
時(shí)值春節(jié)假期期間，武漢新型冠狀病毒肺炎感染事件為中國(guó)最重要的節(jié)日蒙上了一層陰影；而億萬(wàn)人東西南北流動(dòng)的春運(yùn)，又令肺炎感染事件雪上加霜，也給全國(guó)的交通、醫(yī)院和疾控系統(tǒng)等帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心表示，本次發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒與SARS和MERS冠狀病毒雖同屬于冠狀病毒這一大家族，但基因進(jìn)化分析顯示它們分屬于不同的亞群分支，它不是SARS，也不是MERS病毒，它們的病毒基因序列差異比較大。冠狀病毒在自然界中非常常見(jiàn)，分為很多類型，所造成的危害差別也很大，引起武漢病毒性肺炎疫情的病原體為一種新的冠狀病毒，有別于SARS病毒。

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心和各省市疾病預(yù)防控制中心（簡(jiǎn)稱疾控中心）承擔(dān)著全國(guó)和各個(gè)省市的疾病預(yù)防與控制、應(yīng)急預(yù)警與處置、疫情收集與報(bào)告、監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)、健康教育與促進(jìn)、應(yīng)用研究與指導(dǎo)、業(yè)務(wù)培訓(xùn)與保障、技術(shù)管理與服務(wù)等政府對(duì)社會(huì)的疾病控制職能。

疾控中心的建設(shè)要符合我國(guó)現(xiàn)行的生物安全實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，目前國(guó)際上依據(jù)實(shí)驗(yàn)室所處理對(duì)象的生物危險(xiǎn)程度，把生物安全實(shí)驗(yàn)室分為四級(jí)：一級(jí)對(duì)生物安全隔離的要求最低，四級(jí)最高。我國(guó)目前有兩個(gè)四級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室：湖北武漢BSL-4病毒實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院武漢國(guó)家生物安全實(shí)驗(yàn)室 ）和國(guó)家動(dòng)物疫病防控高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所）。


而三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，即BSL-3實(shí)驗(yàn)室，是國(guó)家及幾乎所有省和直轄市疾控系統(tǒng)中最高等級(jí)的生物安全實(shí)驗(yàn)室，在疾病預(yù)防與控制、應(yīng)急預(yù)警與處置、監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)等工作中發(fā)揮著巨大的作用。BSL-3實(shí)驗(yàn)室相對(duì)于BSL-1實(shí)驗(yàn)室和BSL-2實(shí)驗(yàn)室，主要是進(jìn)行特殊的診斷和研究，脈動(dòng)真空滅菌柜和過(guò)氧化氫
空間滅菌器等都是必不可少的安全設(shè)施。


本次新型冠狀病毒需要在BSL-3實(shí)驗(yàn)室及以上實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所以有極高的無(wú)菌要求。傳遞進(jìn)出的物品都要滅菌，常見(jiàn)待滅菌物質(zhì)有：固體（如金屬器械、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室玻璃器具等），多孔物質(zhì)（如衣物、試管等），開(kāi)口的液體容器（如實(shí)驗(yàn)室內(nèi)裝滿水溶液的三角瓶等），生物廢棄物（如帶菌的培養(yǎng)基、動(dòng)物尸體）等。

而如何保證脈動(dòng)真空滅菌柜滅菌效果是至關(guān)重要的，因?yàn)锽SL-3實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程所產(chǎn)生的固體或少量液體廢棄物中含有病毒和細(xì)菌等有害物質(zhì)，若病毒等有害物質(zhì)未完全滅活被排出實(shí)驗(yàn)室，其對(duì)周邊環(huán)境有很大污染風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)�將致命病毒傳播出去，因此必須要�?duì)BSL-3實(shí)驗(yàn)室脈動(dòng)真空滅菌柜滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證，把污染風(fēng)險(xiǎn)降到最低程度。

BSL-3實(shí)驗(yàn)室脈動(dòng)真空滅菌柜滅菌效果監(jiān)測(cè)方法主要包括以下幾類：

一、物理參數(shù)監(jiān)測(cè)
在脈動(dòng)真空滅菌柜的HMI界面上直接監(jiān)視腔體和夾套溫度、壓力、滅菌時(shí)間等參數(shù)，并使用打印機(jī)打印、記錄下來(lái)。另外，脈動(dòng)真空滅菌柜在整個(gè)工作流程過(guò)程中，若有溫度或壓力未滿足參數(shù)設(shè)定值要求，則系統(tǒng)會(huì)發(fā)出報(bào)警，要求運(yùn)維人員對(duì)相應(yīng)影響因素進(jìn)行改進(jìn)。

脈動(dòng)真空滅菌柜每次運(yùn)行均須對(duì)物理參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，如滅菌階段溫度、壓力和滅菌時(shí)間等。若滅菌程序運(yùn)行過(guò)程中有報(bào)警發(fā)生，必須消除故障后再次運(yùn)行該程序，直到程序完全運(yùn)行且無(wú)報(bào)警發(fā)生方可開(kāi)門(mén)取出廢棄物。

二、化學(xué)監(jiān)測(cè)
化學(xué)監(jiān)測(cè)是利用化學(xué)指示劑（CI= Chemical Indicator）在一定溫度、作用時(shí)間與飽和真空適當(dāng)結(jié)合的條件下受熱變色的特點(diǎn)，用于間接指示滅菌效果或滅菌過(guò)程的監(jiān)測(cè)方法�；瘜W(xué)監(jiān)測(cè)常用的方法有：
1）BD測(cè)試：用于檢查滅菌器腔體經(jīng)抽真空后殘留冷空氣的濃度，監(jiān)測(cè)真空水平、是否漏氣等，殘余冷空氣的存在是滅菌器滅菌失敗的主要原因。測(cè)試時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)BD測(cè)試包放于滅菌器排氣口上方，滅菌器內(nèi)不能放入其它待滅菌物品。循環(huán)完成后，取出BD包驗(yàn)證是否滿足要求。BSL-3實(shí)驗(yàn)室每日開(kāi)始滅菌運(yùn)行前進(jìn)行，合格后方可使用。

2）指示膠帶：放在滅菌包外，BSL-3實(shí)驗(yàn)室每個(gè)滅菌包包外均應(yīng)貼有包外化學(xué)指示膠帶或包外指示卡，用于指示每一包物品是否經(jīng)過(guò)了滅菌處理。

3）指示卡：可以指示滅菌溫度和持續(xù)作用時(shí)間，以間接指示滅菌效果。監(jiān)測(cè)時(shí)應(yīng)放于測(cè)試包或待滅菌包內(nèi)。每次滅菌都要使用，每包必用。滅菌后指示色塊達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)顏色為合格，若發(fā)現(xiàn)包內(nèi)指示卡不合格，應(yīng)找出原因，重新滅菌處理直到合格為止。

三、生物監(jiān)測(cè)：生物監(jiān)測(cè)是一種利用生物指示劑（BI= Biological Indicator）對(duì)脈動(dòng)真空滅菌器滅菌效果進(jìn)行驗(yàn)證的重要監(jiān)測(cè)方法。將純棉手術(shù)斤折疊成23cm x 23cm x 15cm大小的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包，將兩支嗜熱脂肪地芽孢桿菌（ATCC7953）放于包中心，將試驗(yàn)包置于滅菌器腔體冷凝水排放口上方，門(mén)關(guān)閉并密封后從程序列表中選擇固體滅菌程序，滅菌周期完成后從包中取出，擠碎指示管內(nèi)安瓿讓培養(yǎng)液浸透管內(nèi)菌片，放于56℃專用恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，連同陽(yáng)性對(duì)照管觀察結(jié)果。所有包內(nèi)滅菌后指示管內(nèi)培養(yǎng)液均沒(méi)有變色，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)培養(yǎng)液變成黃色，可判定滅菌合格。脈動(dòng)真空滅菌器每周應(yīng)進(jìn)行一次生物監(jiān)測(cè)。

BSL-3實(shí)驗(yàn)室過(guò)氧化氫空間滅菌器滅菌效果監(jiān)測(cè)方法：

不同于脈動(dòng)真空滅菌器是對(duì)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程所產(chǎn)生的固體或液體廢棄物進(jìn)行滅菌，氣化過(guò)氧化氫空間滅菌系統(tǒng)是對(duì)BSL-3實(shí)驗(yàn)室物體表面及空間進(jìn)行消毒或滅菌，能有效降低生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物負(fù)載，也能保證生物安全實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌操作環(huán)境。

不同的BSL-3實(shí)驗(yàn)室，需要設(shè)計(jì)不同的過(guò)氧化氫空間滅菌方案。過(guò)氧化氫空間滅菌器滅菌效果的驗(yàn)證時(shí)通過(guò)在難以滅菌的位置處放置BI生物指示劑、CI化學(xué)指示劑，如天花板、地板等難以到達(dá)的角落。CI化學(xué)指示劑變色均勻，BI生物指示劑不銹鋼片上分布有嗜熱脂肪地芽孢桿菌（ATCC12980），滅菌后在55-60℃專用恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)以檢測(cè)滅菌效果，BI是判斷滅菌成功與否的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

使用生物監(jiān)測(cè)進(jìn)行滅菌效果的驗(yàn)證時(shí)，BI生物指示劑，即嗜熱脂肪地芽孢桿菌的培養(yǎng)對(duì)恒溫培養(yǎng)箱具有較高的要求：

1. 其中非常重要的是溫度的均一性（TemperatureUniformity/In Space）：例如在做56℃嗜熱脂肪地芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)，要求溫度均一性為±1℃，即在任一時(shí)刻和擱板上任一位置處，溫度均在55~57℃范圍之內(nèi)，超出0.1℃即視為偏差和不合格。

2. 升降溫時(shí)間：微生物實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱的使用是非常頻繁的，有時(shí)候一段時(shí)間內(nèi)開(kāi)關(guān)門(mén)的次數(shù)會(huì)較多，使腔體內(nèi)溫度較快的出現(xiàn)偏差。如何保證恒溫培養(yǎng)箱在關(guān)門(mén)之后進(jìn)行快速的溫度恢復(fù)，是衡量其性能的重要因素，故疾控系統(tǒng)、以及出入境檢疫檢驗(yàn)部門(mén)和制藥領(lǐng)域的微生物實(shí)驗(yàn)室更傾向于采用不銹鋼電阻加熱管和壓縮機(jī)制冷的恒溫培養(yǎng)箱。

3. 培養(yǎng)效果：有些恒溫培養(yǎng)箱經(jīng)過(guò)幾天運(yùn)行之后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液干燥凝固的情況，造成菌體培養(yǎng)失敗或失效。恒溫培養(yǎng)箱采用頂部回風(fēng)和側(cè)面送風(fēng)的循環(huán)方式是避免這種情況的一種比較合理的設(shè)計(jì)。
恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱不僅可以培養(yǎng)BI生物指示劑，用于脈動(dòng)真空滅菌器和過(guò)氧化氫空間滅菌器滅菌效果的監(jiān)測(cè)，保證生物安全實(shí)驗(yàn)室的安全，還可以用于一次性使用衛(wèi)生用品如手套、口罩和防護(hù)服等的微生物檢測(cè)和衛(wèi)生保證。

如GB19082-2009和GB15979-2002中規(guī)定了產(chǎn)品微生物檢測(cè)方法，其中大腸桿菌檢測(cè)方法：取樣液5mL，接種50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為大腸桿菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng)18-24h，觀察平板上菌落形態(tài)。典型的大腸桿菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。取疑似菌落1-2個(gè)作革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。

除了以上生物安全實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱在制藥領(lǐng)域無(wú)菌控制方面也發(fā)揮著必不可少的作用，如《中國(guó)藥典》2015版四部和2020版四部生物檢定通則增修訂（公示中）中都明確了其應(yīng)用和微生物培養(yǎng)的方法。

2020版四部生物檢定通則增加了滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則，用于脈動(dòng)真空滅菌器和過(guò)氧化氫空間滅菌器滅菌效果的生物監(jiān)測(cè)。2015版四部中如1101無(wú)菌檢查法，用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、輔料、原料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法，防止微生物污染。恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱主要應(yīng)用包含：培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶是否合格的檢測(cè)；空氣、純化水、設(shè)備表面等以及原料、樣品、半成品的檢測(cè)，防止微生物污染，保證無(wú)菌操作和生產(chǎn)，此時(shí)培養(yǎng)的真菌或細(xì)菌所需的溫度為20~25℃，30~35℃，35~37℃和42~43℃等，要求的溫度均一性仍為±1℃。

一般疾控系統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室和出入境檢疫檢驗(yàn)部門(mén)使用幾臺(tái)小的恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱（Reach-In）進(jìn)行BI生物指示劑或細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)即可滿足要求。而對(duì)于一些制藥企業(yè)來(lái)說(shuō)，無(wú)論從實(shí)驗(yàn)室空間占用方面，還是培養(yǎng)箱內(nèi)部容積和價(jià)格成本方面來(lái)說(shuō)，多臺(tái)小的恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱并不是最優(yōu)的解決方案，步入式培養(yǎng)箱（Walk-In）反而是更好的選擇。