新冠肺炎在數(shù)月蔓延全球，疫情的傳播程度和嚴(yán)重性令人深感擔(dān)憂。在繁忙的戰(zhàn)疫期間，中國(guó)展示了在全球公共衛(wèi)生事業(yè)上盡心盡力的大國(guó)擔(dān)當(dāng)。國(guó)內(nèi)疫情正在退潮，國(guó)外困難卻越來(lái)越明顯的浮現(xiàn)出來(lái)。對(duì)此新冠肺炎病毒檢測(cè)以及治療藥物研究就越來(lái)越重要。全球科研機(jī)構(gòu)以及企業(yè)研發(fā)人員都積極投入到此次研究中來(lái)。

背景

冠狀病毒（Coronaviruses，CoV）屬于尼多病毒目冠狀病毒科，為有包膜的單股、正鏈RNA病毒，分為α，β和γ三個(gè)屬。冠狀病毒粒子呈球形或不規(guī)則形，有囊膜，大小為80-120 nm。其基因組的5'端帶有帽子結(jié)構(gòu)，其后包含6-10個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frames，ORFs)。占據(jù)基因組2/3的第一個(gè)閱讀框編碼復(fù)制酶，基因組的另1/3主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白，一般包括纖突蛋白(spike，S)、小包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance，M)、核蛋白(nucleocapsid，N)。E蛋白和M蛋白主要參與病毒的裝配過(guò)程，N蛋白包裹基因組形成核蛋白復(fù)合體
  冠狀病毒主要通過(guò)刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S glycoprotein）與宿主細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒的入侵并決定病毒組織或宿主嗜性。刺突糖蛋白（S蛋白）是一類很大的三聚體跨膜糖蛋白，其在病毒表面形成特殊的花冠結(jié)構(gòu)，冠狀病毒因此而得名。S蛋白可識(shí)別宿主細(xì)胞受體并介導(dǎo)膜融合，對(duì)于病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞至關(guān)重要，是病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因子。SARS-CoV-2和2003年的SARS病毒一樣，都是通過(guò)識(shí)別人類宿主的ACE2蛋白從而進(jìn)入細(xì)胞的，尤其是，S蛋白結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)（Receptor binding domain，RBD）直接參與了宿主受體的識(shí)別，該區(qū)域的氨基酸變異會(huì)導(dǎo)致病毒的種屬嗜性和感染特性的變化。因此，獲取SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，將有助于理解新冠病毒對(duì)比SARS病毒與ACE2結(jié)合的差異，以及SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2 結(jié)合時(shí)的存在狀態(tài)，因此，SARS-CoV-2的S蛋白與ACE2蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)為進(jìn)一步精確地疫苗設(shè)計(jì)以及抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。

 

在新冠肺炎（COVID-19）疫情爆發(fā)之后沒(méi)多久，中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所和武漢病毒研究所的科學(xué)家就先后發(fā)現(xiàn)：新型冠狀病毒和SARS病毒一樣，也是通過(guò)利用S蛋白結(jié)合人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白進(jìn)入細(xì)胞的。

從那之后，新冠病毒的S蛋白和細(xì)胞表面的ACE2成為科學(xué)家們的研究重點(diǎn)。日前，美國(guó)德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校Jason S. McLellan團(tuán)隊(duì)和西湖大學(xué)周強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室先后利用冷凍電鏡技術(shù)分別首次成功解析了S蛋白（spike protein）和ACE2的完整結(jié)構(gòu)，以及完整ACE2蛋白與新冠病毒S蛋白受體結(jié)構(gòu)域（RBD）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

 

Jason S. McLellan 研究組中，研究人員獲得了處于預(yù)融合構(gòu)象的新型冠狀病毒突刺蛋白三聚體的冷凍電鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)，其分辨率為 3.5Å。三聚體的主要狀態(tài)為三個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）之一向上旋轉(zhuǎn)為受體可至構(gòu)象。

  生物物理和結(jié)構(gòu)證據(jù)表明，較之 SARS 冠狀病毒，新型冠狀病毒的三聚體更容易與細(xì)胞表面的 ACE2 蛋白結(jié)合。另外，研究者們也測(cè)試了幾個(gè)已經(jīng)發(fā)表過(guò)的 SARS 冠狀病毒 RBD 特異性單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)它們與新冠病毒 S 突刺蛋白沒(méi)有明顯的結(jié)合，這表明兩種病毒 RBD 之間的抗體交叉反應(yīng)性可能受到限制。
 

預(yù)融合構(gòu)象中的 2019-nCoV S 蛋白結(jié)構(gòu)
 

 

而西湖大學(xué)周強(qiáng)團(tuán)隊(duì)則借助于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B0AT1，成功在實(shí)驗(yàn)室里獲得了穩(wěn)定的人細(xì)胞受體ACE2的結(jié)構(gòu)，并利用冷凍電鏡技術(shù)，解析了ACE2的完整三維結(jié)構(gòu)。

發(fā)現(xiàn)了ACE2是以二聚體的形式存在，同時(shí)具有開(kāi)放和關(guān)閉兩種構(gòu)象，而且兩種構(gòu)象都有與冠狀病毒結(jié)合的界面。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)ACE2二聚體能結(jié)合兩個(gè)SARS冠狀病毒的S蛋白三聚體。

此外，還發(fā)現(xiàn)ACE2細(xì)胞外的那部分（PD）存在6個(gè)糖基化位點(diǎn)，這比之前的研究成果多出了4個(gè)。

兩個(gè)ACE2蛋白聚合在一起

 

為了揭示ACE2與新冠病毒之間的識(shí)別細(xì)節(jié)，他們獲取了新冠病毒S蛋白的RBD。發(fā)現(xiàn)這個(gè)RBD就是新冠病毒識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞受體ACE2的關(guān)鍵。

有了S蛋白的RBD之后，他們將RBD與之前獲得的ACE2-B0AT1復(fù)合體，按照接近1：1的比例混合，讓它們自由結(jié)合。然后獲得復(fù)合物，用冷凍電鏡給它們拍照片。最后獲得了分辨率達(dá)2.9Å的RBD-ACE2-B0AT1復(fù)合體。

基于這個(gè)復(fù)合體，他們的第一個(gè)發(fā)現(xiàn)是：雖然ACE2二聚體有開(kāi)放和關(guān)閉兩種構(gòu)象，而且都有與冠狀病毒結(jié)合的界面；但是與S蛋白R(shí)BD結(jié)合的ACE2-B0AT1復(fù)合體只有關(guān)閉構(gòu)象。

RBD-ACE2-B0AT1 復(fù)合物的冷凍電鏡密度圖，框內(nèi)為RBD（黃色）與ACE2（藍(lán)色）的相互作用界面
 

 

王新泉和張林琦團(tuán)隊(duì)選擇在Hi5昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)新冠病毒S蛋白的RBD和人細(xì)胞受體ACE2細(xì)胞外部分。很顯然，這個(gè)研究的目的就是想看清楚新冠病毒S蛋白的RBD與ACE2的結(jié)合部分究竟長(zhǎng)什么樣。

經(jīng)過(guò)一些列的表達(dá)和純化，得到了新冠病毒S蛋白的RBD（Cys336至Glu516殘基）和人細(xì)胞受體ACE2細(xì)胞外部分（Ser19至Asp615殘基）的晶體結(jié)構(gòu)，然后利用X射線衍射技術(shù)，最終獲得了分辨率達(dá)到2.5Å三維結(jié)構(gòu)圖。

他們發(fā)現(xiàn)新冠病毒S蛋白的RBD的18個(gè)氨基酸殘基，與人細(xì)胞受體ACE2細(xì)胞外部分的20個(gè)氨基酸殘基結(jié)合，結(jié)合面積在1700Ų左右。對(duì)于SARS病毒而言，是16個(gè)氨基酸對(duì)20個(gè)氨基酸。

與新冠病毒結(jié)合和SARS病毒結(jié)合的那20個(gè)ACE2的氨基酸殘基，有17個(gè)是一樣的。在新冠病毒RBD與ACE2的結(jié)合界面，有17個(gè)氫鍵和1個(gè)鹽橋；而SARS病毒和ACE2的結(jié)合界面，有12個(gè)氫鍵和2個(gè)鹽橋。

新冠病毒RBD與ACE2結(jié)合

 

這些研究從近原子水平的分辨率解析了新型冠狀病毒 S 蛋白，為進(jìn)一步精確地疫苗設(shè)計(jì)以及抗病毒藥物的發(fā)現(xiàn)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)，為后續(xù)對(duì)抗新冠的疫苗和抗病毒藥物研發(fā)提供了重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

基于S蛋白及其與ACE2相互作用的治療策略已經(jīng)在眾多致力于解決這次全球性公共衛(wèi)生事件的制藥企業(yè)和科研院所中廣泛開(kāi)展并取得了初步的進(jìn)展。我們相信，隨著更多的研究和臨床試驗(yàn)拼成一幅完整的拼圖，我們終將打贏這場(chǎng)防疫之戰(zhàn)。

針對(duì)新冠病毒，目前依然缺少蛋白類、抗體類的診斷和治療手段。對(duì)于新冠病毒的診斷研發(fā)，華安生物將以N蛋白和S蛋白為主要研發(fā)目標(biāo)，而針對(duì)新冠病毒的抗體藥物治療手段，將以S蛋白和ACE2的中和抗體為研發(fā)目標(biāo)。華安生物研發(fā)部已經(jīng)開(kāi)發(fā)了SARS-CoV-2一系列蛋白及抗體，近期將會(huì)上市。

 

參考文獻(xiàn)：

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