藻類表型研究全面解決方案
藻類是藍藻門、眼蟲藻門、金藻門、甲藻門、綠藻門、褐藻門、紅藻門等一系列水生生物的總稱。其形態(tài)種類眾多，小至微米級的單細(xì)胞微藻，大至長達幾米乃至幾十米的大型褐藻。藻類作為水體中最重要的初級生產(chǎn)者，對整個生態(tài)系統(tǒng)乃至地球圈的穩(wěn)定都起著極為重要的作用。萊茵衣藻、藍藻等模式藻類為功能基因、生物進化、光合作用等研究提供了極佳的材料。同時，很多經(jīng)濟藻類也在食品、醫(yī)藥、能源等行業(yè)中扮演重要角色。而水華、赤潮等有害生態(tài)現(xiàn)象也是由藻類造成的。因此，對藻類的研究一直是生物學(xué)和生態(tài)學(xué)中非常重要的熱點。
目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域最為引人注目的研究熱點之一——表型組學(xué)研究，還主要集中在植物/作物領(lǐng)域。在藻類領(lǐng)域，表型組學(xué)研究剛剛起步，但發(fā)展速度極為迅猛。藻類表型組學(xué)一方面是藻類基因組學(xué)的補充與驗證，解釋基因組和環(huán)境因素對植物表型的復(fù)雜作用及中間的變化過程；另一方面可以用于經(jīng)濟藻類的抗逆生理研究和遺傳育種，全面分析藻類表型，獲取更優(yōu)良的經(jīng)濟藻種；還可以用于水華、赤潮的發(fā)生機理研究。
藻類表型組學(xué)需要全面分析藻類的表型特征，尤其是光合生理、形態(tài)、顏色、色素組成與分布、不同色素的光合貢獻、脅迫生理等方面的測量與分析，使藻類表型數(shù)字化、生理生態(tài)及功能可視化。這就需要針對藻類表型專門設(shè)計的技術(shù)解決方案。
方案中所列舉的儀器可以根據(jù)具體研究需求靈活組合，而且所有儀器的國際認(rèn)可度極高，國內(nèi)外科學(xué)家均使用這些儀器發(fā)表了大量科研論文。下面介紹部分系統(tǒng)方案的應(yīng)用案例。
中科院水生生物所王強研究員為了研究亞硝酸鹽脅迫對藍藻Synechocystis sp. PCC 6803光系統(tǒng)II的脅迫機制，使用AquaPen手持式藻類熒光測量儀、FL3500葉綠素?zé)晒鈨x（FL6000之前型號）和TL葉綠素?zé)後尮庀到y(tǒng)，分別測量分析了Fv/Fm最大光化學(xué)效率、OJIP快速熒光動力學(xué)曲線、QA-再氧化動力學(xué)曲線、S-state測量和TL熱釋光曲線。研究最終證明亞硝酸鹽脅迫首先影響Synechocystis sp. PCC 6803 光系統(tǒng)II受體側(cè)(Zhan X, 2017)。
萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的新陳代謝對環(huán)境變化有很好的適應(yīng)性。加利福尼亞大學(xué)的Daniela Strenkert嘗試模擬一個光暗周期，研究這一天中萊茵衣藻的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組變化。這一研究首先要求能夠精確模擬一個動態(tài)變化的培養(yǎng)環(huán)境，同時還要對相關(guān)培養(yǎng)環(huán)境及藻類密度、生理等進行監(jiān)測。這樣才能為后續(xù)的組學(xué)分析提供盡量精準(zhǔn)的樣品。而目前能達到這一要求的藻類培養(yǎng)監(jiān)測儀器只有FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)。
2006年，捷克在南極James Ross島建設(shè)了Johann Gregor Mendel站。駐扎該站的捷克馬薩里克大學(xué)科研人員從2007年就開展研究當(dāng)?shù)卦孱惡偷匾聦δ蠘O溫度升高的響應(yīng)，從而評估溫室效應(yīng)對南極生態(tài)系統(tǒng)的影響。當(dāng)時他們使用了專門加強極地適應(yīng)能力的AquaPen/FluorPen系列手持式葉綠素?zé)晒鉁y量儀來檢測藻類和地衣的光合生理和生長狀態(tài)。AquaPen/FluorPen既可以手動操作，也具備無人值守監(jiān)測葉綠素?zé)晒獾墓δ�，在南極的嚴(yán)酷環(huán)境下表現(xiàn)良好。
所有光合生物都必須要應(yīng)對過量光照來避免光合氧化脅迫。對于植物和綠藻來說，高光的最快響應(yīng)機制就是光系統(tǒng)II的非光化學(xué)淬滅（NPQ）。這一過程允許光系統(tǒng)II將過量能量以熱量形式安全地耗散掉。PsbS蛋白是這一過程中的重要傳感器。
為了確定PsbS蛋白在萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的NPQ和光保護中的作用，艾克斯－馬賽大學(xué)Tibiletti T等培養(yǎng)了可以表達藻類或擬南芥psbS基因的葉綠體轉(zhuǎn)基因株。通過FluorCam開放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進行的NPQ成像分析最終表明，兩種PsbS蛋白都可以增強萊茵衣藻野生型和npq4突變株的NPQ，但通過Fv/Fm測量沒有觀察到明確的光保護活性。
Miguel Costa Leal等利用FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)，對珊瑚共生體的光合能力及生態(tài)變化進行了研究。FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)除了進行葉綠素?zé)晒獬上駵y量，還可以進行植被歸一化指數(shù)NDVI成像與綠色熒光蛋白GFP成像（也可以測量其他熒光蛋白）。在本研究中，NDVI成像反映其葉綠素的分布及濃度變化，GFP成像則指示了含有GFP類似蛋白的刺胞動物組織，葉綠素?zé)晒獬上駝t展示了珊瑚的光合能力。同時多光譜熒光還可以進行次生代謝組與病害表型研究及其他熒光蛋白成像，如YFP、BFP、RFP等。
因此，僅一臺FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)就可以完成相當(dāng)全面的藻類表型研究：光合表型、NDVI反射光譜指數(shù)、熒光蛋白、次生代謝水平與分布。
大理石雕像上經(jīng)常會覆蓋上綠色或黑灰色的生物膜。這種生物膜是藍藻、藻類和真菌的混合體，并會逐漸侵蝕大理石。為了對戶外大理石雕像進行保護，歐洲相關(guān)科研機構(gòu)開展了大量相關(guān)的研究工作。而為了評估生物膜的活性以及清洗后的效果，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)無疑是最為便捷、直接的技術(shù)。意大利弗洛倫薩應(yīng)用物理研究所的Marta Mascalchi使用激光清除大理石上的生物膜。FluorCam便攜式熒光成像儀為其檢測清除效果并優(yōu)化激光參數(shù)提供了最有力的數(shù)據(jù)。
進行藻類產(chǎn)油生物能源開發(fā)，首先就是獲得高生物量的優(yōu)良藻種。非光化學(xué)淬滅NPQ代表著藻類光合系統(tǒng)沒有利用而熱耗散掉的能量。那么減小NPQ，勢必能提高其生物量。本研究中使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)篩選了兩種NPQ減小的衣藻突變株，同時通過MC1000 8通道藻類培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)探索其最佳的培養(yǎng)條件。MC1000 8通道藻類培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)可以認(rèn)為是FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)的簡化版，可動態(tài)調(diào)控光照、溫度與光暗周期并通過測量OD監(jiān)測藻類生長動態(tài)，非常適用于藻類的多重復(fù)快速培養(yǎng)。
2019年中國海洋大學(xué)裝備了國內(nèi)首套海洋生物表型組學(xué)光學(xué)成像分析系統(tǒng)，這一系統(tǒng)包含以下子系統(tǒng)：
FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)是FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的高級擴展產(chǎn)品，既可用于葉綠素?zé)晒鈩討B(tài)成像分析，又可用于長波段UV紫外光對植物葉片激發(fā)產(chǎn)生的MCF多光譜熒光成像測量分析，還可選配綠色熒光蛋白GFP等穩(wěn)態(tài)熒光的成像測量。FluorCam廣泛應(yīng)用于藻類光合功能基因、逆境脅迫、藻類生態(tài)、經(jīng)濟藻類育種以及生物能源開發(fā)等研究。其中，MCF多光譜熒光尤其適用于病害造成的次生代謝組總體分析及藻類防御機制研究。
AlgaTech客戶定制藻類高通量表型分析平臺由樣品自動傳送系統(tǒng)、光譜成像站和分析軟件組成，可選配多光譜成像、高光譜成像、葉綠素?zé)晒獬上�、多光譜熒光成像等成像工作站，每個工作站可獨立運行，可同步監(jiān)測藻類光合作用、pH及溫度，還可選配不同類型藻類培養(yǎng)與在線分析系統(tǒng)。
目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域最為引人注目的研究熱點之一——表型組學(xué)研究，還主要集中在植物/作物領(lǐng)域。在藻類領(lǐng)域，表型組學(xué)研究剛剛起步，但發(fā)展速度極為迅猛。藻類表型組學(xué)一方面是藻類基因組學(xué)的補充與驗證，解釋基因組和環(huán)境因素對植物表型的復(fù)雜作用及中間的變化過程；另一方面可以用于經(jīng)濟藻類的抗逆生理研究和遺傳育種，全面分析藻類表型，獲取更優(yōu)良的經(jīng)濟藻種；還可以用于水華、赤潮的發(fā)生機理研究。
藻類表型組學(xué)需要全面分析藻類的表型特征，尤其是光合生理、形態(tài)、顏色、色素組成與分布、不同色素的光合貢獻、脅迫生理等方面的測量與分析，使藻類表型數(shù)字化、生理生態(tài)及功能可視化。這就需要針對藻類表型專門設(shè)計的技術(shù)解決方案。
| 按表型數(shù)據(jù)類型分類： | |
| 藻類培養(yǎng)與常規(guī)生理表型數(shù)據(jù)在線監(jiān)測儀器 |
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| 光合作用表型 |
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| 光譜表型 |
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| 高通量綜合表型分析 |
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| 按使用方式分類： | |
| 監(jiān)測式儀器 |
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| 便攜式儀器 |
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| 實驗室儀器 |
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| 高通量自動測量系統(tǒng) |
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方案中所列舉的儀器可以根據(jù)具體研究需求靈活組合，而且所有儀器的國際認(rèn)可度極高，國內(nèi)外科學(xué)家均使用這些儀器發(fā)表了大量科研論文。下面介紹部分系統(tǒng)方案的應(yīng)用案例。
- 藍藻光合作用機理的深入研究
中科院水生生物所王強研究員為了研究亞硝酸鹽脅迫對藍藻Synechocystis sp. PCC 6803光系統(tǒng)II的脅迫機制，使用AquaPen手持式藻類熒光測量儀、FL3500葉綠素?zé)晒鈨x（FL6000之前型號）和TL葉綠素?zé)後尮庀到y(tǒng)，分別測量分析了Fv/Fm最大光化學(xué)效率、OJIP快速熒光動力學(xué)曲線、QA-再氧化動力學(xué)曲線、S-state測量和TL熱釋光曲線。研究最終證明亞硝酸鹽脅迫首先影響Synechocystis sp. PCC 6803 光系統(tǒng)II受體側(cè)(Zhan X, 2017)。
- 萊茵衣藻分子事件的多組學(xué)解析
萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的新陳代謝對環(huán)境變化有很好的適應(yīng)性。加利福尼亞大學(xué)的Daniela Strenkert嘗試模擬一個光暗周期，研究這一天中萊茵衣藻的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組變化。這一研究首先要求能夠精確模擬一個動態(tài)變化的培養(yǎng)環(huán)境，同時還要對相關(guān)培養(yǎng)環(huán)境及藻類密度、生理等進行監(jiān)測。這樣才能為后續(xù)的組學(xué)分析提供盡量精準(zhǔn)的樣品。而目前能達到這一要求的藻類培養(yǎng)監(jiān)測儀器只有FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)。
- 監(jiān)測南極藻類與地衣的氣候響應(yīng)
2006年，捷克在南極James Ross島建設(shè)了Johann Gregor Mendel站。駐扎該站的捷克馬薩里克大學(xué)科研人員從2007年就開展研究當(dāng)?shù)卦孱惡偷匾聦δ蠘O溫度升高的響應(yīng)，從而評估溫室效應(yīng)對南極生態(tài)系統(tǒng)的影響。當(dāng)時他們使用了專門加強極地適應(yīng)能力的AquaPen/FluorPen系列手持式葉綠素?zé)晒鉁y量儀來檢測藻類和地衣的光合生理和生長狀態(tài)。AquaPen/FluorPen既可以手動操作，也具備無人值守監(jiān)測葉綠素?zé)晒獾墓δ�，在南極的嚴(yán)酷環(huán)境下表現(xiàn)良好。
- 萊茵衣藻高光脅迫響應(yīng)的分子機制
所有光合生物都必須要應(yīng)對過量光照來避免光合氧化脅迫。對于植物和綠藻來說，高光的最快響應(yīng)機制就是光系統(tǒng)II的非光化學(xué)淬滅（NPQ）。這一過程允許光系統(tǒng)II將過量能量以熱量形式安全地耗散掉。PsbS蛋白是這一過程中的重要傳感器。
為了確定PsbS蛋白在萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的NPQ和光保護中的作用，艾克斯－馬賽大學(xué)Tibiletti T等培養(yǎng)了可以表達藻類或擬南芥psbS基因的葉綠體轉(zhuǎn)基因株。通過FluorCam開放式葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進行的NPQ成像分析最終表明，兩種PsbS蛋白都可以增強萊茵衣藻野生型和npq4突變株的NPQ，但通過Fv/Fm測量沒有觀察到明確的光保護活性。
- 珊瑚共生體的表型研究
Miguel Costa Leal等利用FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)，對珊瑚共生體的光合能力及生態(tài)變化進行了研究。FluorCam封閉式多光譜熒光成像系統(tǒng)除了進行葉綠素?zé)晒獬上駵y量，還可以進行植被歸一化指數(shù)NDVI成像與綠色熒光蛋白GFP成像（也可以測量其他熒光蛋白）。在本研究中，NDVI成像反映其葉綠素的分布及濃度變化，GFP成像則指示了含有GFP類似蛋白的刺胞動物組織，葉綠素?zé)晒獬上駝t展示了珊瑚的光合能力。同時多光譜熒光還可以進行次生代謝組與病害表型研究及其他熒光蛋白成像，如YFP、BFP、RFP等。
因此，僅一臺FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)就可以完成相當(dāng)全面的藻類表型研究：光合表型、NDVI反射光譜指數(shù)、熒光蛋白、次生代謝水平與分布。
- 生物侵蝕防治的研究
大理石雕像上經(jīng)常會覆蓋上綠色或黑灰色的生物膜。這種生物膜是藍藻、藻類和真菌的混合體，并會逐漸侵蝕大理石。為了對戶外大理石雕像進行保護，歐洲相關(guān)科研機構(gòu)開展了大量相關(guān)的研究工作。而為了評估生物膜的活性以及清洗后的效果，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)無疑是最為便捷、直接的技術(shù)。意大利弗洛倫薩應(yīng)用物理研究所的Marta Mascalchi使用激光清除大理石上的生物膜。FluorCam便攜式熒光成像儀為其檢測清除效果并優(yōu)化激光參數(shù)提供了最有力的數(shù)據(jù)。
- 生物能源開發(fā)
進行藻類產(chǎn)油生物能源開發(fā)，首先就是獲得高生物量的優(yōu)良藻種。非光化學(xué)淬滅NPQ代表著藻類光合系統(tǒng)沒有利用而熱耗散掉的能量。那么減小NPQ，勢必能提高其生物量。本研究中使用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)篩選了兩種NPQ減小的衣藻突變株，同時通過MC1000 8通道藻類培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)探索其最佳的培養(yǎng)條件。MC1000 8通道藻類培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)可以認(rèn)為是FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng)的簡化版，可動態(tài)調(diào)控光照、溫度與光暗周期并通過測量OD監(jiān)測藻類生長動態(tài)，非常適用于藻類的多重復(fù)快速培養(yǎng)。
- 海洋生物表型組學(xué)光學(xué)成像分析系統(tǒng)
2019年中國海洋大學(xué)裝備了國內(nèi)首套海洋生物表型組學(xué)光學(xué)成像分析系統(tǒng)，這一系統(tǒng)包含以下子系統(tǒng)：
- FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)
- FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)
- FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)
- Specim IQ 高光譜成像儀
- MC1000 8通道藻類培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)
FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)是FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的高級擴展產(chǎn)品，既可用于葉綠素?zé)晒鈩討B(tài)成像分析，又可用于長波段UV紫外光對植物葉片激發(fā)產(chǎn)生的MCF多光譜熒光成像測量分析，還可選配綠色熒光蛋白GFP等穩(wěn)態(tài)熒光的成像測量。FluorCam廣泛應(yīng)用于藻類光合功能基因、逆境脅迫、藻類生態(tài)、經(jīng)濟藻類育種以及生物能源開發(fā)等研究。其中，MCF多光譜熒光尤其適用于病害造成的次生代謝組總體分析及藻類防御機制研究。
- AlgaTech藻類高通量表型分析平臺
AlgaTech客戶定制藻類高通量表型分析平臺由樣品自動傳送系統(tǒng)、光譜成像站和分析軟件組成，可選配多光譜成像、高光譜成像、葉綠素?zé)晒獬上�、多光譜熒光成像等成像工作站，每個工作站可獨立運行，可同步監(jiān)測藻類光合作用、pH及溫度，還可選配不同類型藻類培養(yǎng)與在線分析系統(tǒng)。
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