細(xì)胞灌流培養(yǎng)是蛋白藥物連續(xù)流生產(chǎn)工藝的重要一環(huán)，而高效、低消耗的培養(yǎng)基則是細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝成敗的關(guān)鍵因素。在fed-batch工藝占主導(dǎo)的今天，市面上缺乏灌流專用的平臺培養(yǎng)基。生物制藥企業(yè)在探索灌流工藝時，往往只能使用fed-batch基礎(chǔ)培養(yǎng)基(或混合少量補(bǔ)料培養(yǎng)基)來作為灌流培養(yǎng)基使用，這些培養(yǎng)基沒有經(jīng)過專門的灌流營養(yǎng)優(yōu)化，往往細(xì)胞密度和產(chǎn)量不會太高，而且灌流體積比較大，增加生產(chǎn)成本。

本文通過對EX-CELL^® Advanced™ HD Perfusion Medium的產(chǎn)品開發(fā)過程進(jìn)行案例分析，為生物制藥企業(yè)的平臺化灌流培養(yǎng)基開發(fā)工作提供思路借鑒。

最早的灌流培養(yǎng)基原型是利用默克CHO細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)庫（Basal media diversity panel）來生成。我們將庫中不同培養(yǎng)基原型，進(jìn)行DOE混料設(shè)計，生成多個新的混料配方（Mix）平行培養(yǎng)進(jìn)行對比，并采集相關(guān)培養(yǎng)數(shù)據(jù)，以便進(jìn)一步優(yōu)化時進(jìn)行MVA分析。根據(jù)試驗結(jié)果，從中初步確定出兩種最適灌流的混料培養(yǎng)基原型Mix G1 和 Mix P1；將此二種原型經(jīng)過與多種富營養(yǎng)灌流培養(yǎng)基（basal medium enriched with Feed）反復(fù)進(jìn)行反應(yīng)器工藝平行對比，最終決定將混料培養(yǎng)基Mix P1作為灌流原型來進(jìn)一步進(jìn)行營養(yǎng)優(yōu)化。

圖1 整體優(yōu)化流程圖

 
通過對上一輪實(shí)驗數(shù)據(jù)的MVA分析，我們從中找出對灌流工藝關(guān)鍵參數(shù)有顯著影響的營養(yǎng)成分共計11種。然后，采用DOE中心組合設(shè)計（CCD）的方法，對這11種成分的最佳濃度分別進(jìn)行確定。（見下圖2 ）

圖2 關(guān)鍵組分濃度優(yōu)化。等高線圖顯示出11種關(guān)鍵組分中的兩種（組分4，9）對蛋白產(chǎn)量的影響

 
最終，我們得到11種組分優(yōu)化到最佳濃度的全新灌流培養(yǎng)基原型。
 
由于氨基酸在灌流細(xì)胞生長中的特殊重要性，我們又對這種新原型培養(yǎng)基單獨(dú)進(jìn)行了氨基酸優(yōu)化：采用上清分析手段，對灌流中，細(xì)胞在生長和表達(dá)階段的各氨基酸消耗速率分別進(jìn)行測量，根據(jù)測量結(jié)果，我們按照20 pL/cell/day 的CSPR的模型來計算，對培養(yǎng)基中的氨基酸組分進(jìn)一步強(qiáng)化調(diào)整（主要是增加了重要氨基酸的濃度）。氨基酸調(diào)整之后, 培養(yǎng)基的CSPR在幾個測試的細(xì)胞株上均有顯著降低，同時細(xì)胞單產(chǎn)（qp）也得以進(jìn)一步提高。（見下圖3）。

圖3 氨基酸濃度調(diào)整后的效果，在測試CHO-S細(xì)胞株上，CSPR從60 pL/cell/day降低到37 pL/cell/day，同時qp從原來的最高8.4pcd提高到最高11.7pcd。

接著對調(diào)整后原型的氨基酸消耗速率進(jìn)行重新測試發(fā)現(xiàn)：隨著CSPR的降低，細(xì)胞的氨基酸消耗速率也較之前發(fā)生了變化，降低CSPR，某些氨基酸卻出現(xiàn)了過量現(xiàn)象（見下圖4）。

圖4 在提高氨基酸濃度，降低CSPR之后，單細(xì)胞消耗氨基酸的速率也發(fā)生了改變（降低）。

 
這表明，培養(yǎng)基中氨基酸濃度及灌流速率等條件的改變，讓細(xì)胞內(nèi)的某些代謝通路發(fā)生了變化。所以，我們對部分過量的氨基酸進(jìn)行了重新再平衡調(diào)整。

我們用不同細(xì)胞株對調(diào)整后的配方進(jìn)行反應(yīng)器灌流驗證，以測試其廣譜性。結(jié)果顯示，該配方對不同類型細(xì)胞株灌流培養(yǎng)均具有優(yōu)良效果。（見下圖5）

圖5 在40 pL/cell/day的CSPR下灌流超過30天，細(xì)胞數(shù)維持在50*106 vc/mL，同時單位產(chǎn)量也維持穩(wěn)定

 
小結(jié)：
在灌流培養(yǎng)基的開發(fā)過程中，統(tǒng)計學(xué)工具是必不可少的。如通過MVA分析定向找出關(guān)鍵組分，再通過DOE設(shè)計，對關(guān)鍵組分濃度進(jìn)行快速優(yōu)化，從而提升性能，這是灌流培養(yǎng)基開發(fā)的一個重要手段。另外，本案例顯示，氨基酸濃度對灌流效果有相對重要的作用，通過氨基酸濃度的優(yōu)化，較明顯提升了培養(yǎng)效果。但在初次調(diào)整氨基酸濃度后，細(xì)胞的氨基酸代謝也隨著出現(xiàn)了一定的變化（如重新測試后發(fā)現(xiàn)某些氨基酸有過量現(xiàn)象），說明細(xì)胞的氨基酸代謝之間有復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，對氨基酸的調(diào)整需要進(jìn)行反復(fù)摸索，才可找到最佳的濃度組合。
 
 
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