應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)估算有效光反應(yīng)中心含量
PSII可與PSI協(xié)同從水中獲取電子生成還原體、驅(qū)動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)和植物營養(yǎng)循環(huán)。因此有效PSII光反應(yīng)中心（[PSII]active）的含量可作為植物生產(chǎn)力評(píng)估的基礎(chǔ)因子，同時(shí)也是評(píng)估植物光合速率、研究植物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵。而對(duì)于液體樣品，[PSII]active含量同樣是評(píng)估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物對(duì)脅迫的響應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)。但傳統(tǒng)上缺少穩(wěn)定、可靠、快速的 [PSII]active含量的測(cè)量方法。
傳統(tǒng)上對(duì)于[PSII]active的測(cè)量：
本文將介紹加拿大蒙特愛立森大學(xué)的Campbell教授的研究------應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行[PSII]active含量估算的方法。該方法有效解決了傳統(tǒng)測(cè)量方法存在的問題。其原理是：在一定體積下：
a）F’o強(qiáng)度與[PSII]active色素含量相關(guān)；
b）σ’PSII與PSII色素總含量相關(guān)。
因此，F(xiàn)’o/σ’PSII可以代表單位體積的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而這兩個(gè)參數(shù)都可以利用快速飽和及弛豫熒光誘導(dǎo)程序（fast repletion and relaxation (FRR) fluorescence induction）獲得。（注：σ’PSII: 光適應(yīng)狀態(tài)下PSII的有效吸收截面；F’o：光適應(yīng)下的基礎(chǔ)熒光。）
為了證明該方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化熒光淬滅影響很小、測(cè)量快速并且穩(wěn)定、具有時(shí)間分辨性、可應(yīng)用于對(duì)湖泊和海洋水體的初級(jí)生產(chǎn)力的快速評(píng)估，該研究進(jìn)行了209次成對(duì)測(cè)定，對(duì)不同培養(yǎng)和處理?xiàng)l件下的海洋藍(lán)藻、分別在高光和低光處理下的原生態(tài)型球藻、北極和溫帶的綠藻、兩種中心硅藻進(jìn)行測(cè)試。
由于藻類的生理狀態(tài)對(duì)培養(yǎng)密度、光照條件、氣體狀態(tài)、溫度、pH值等都很敏感，進(jìn)而直接影響所得參數(shù)和公式的科學(xué)性，所以需要精確控制培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)狀態(tài)。因此本研究使用FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器對(duì)中心硅藻兩個(gè)藻株分別在2種不同狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)，精確控制營養(yǎng)濃度、溫度、光照，并自動(dòng)進(jìn)行恒化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中儀器自動(dòng)使用水蒸氣飽和的空氣氣泡混勻，避免沉降。（FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器介紹見后附）
之后使用FL3500（當(dāng)前升級(jí)為FL6000）測(cè)量每個(gè)樣品的F’o和σ’PSII，用以計(jì)算[PSII]active。FL3500可自動(dòng)控制和測(cè)量樣品溫度、預(yù)施光照、光化光、單周轉(zhuǎn)飽和光閃、QA再氧化等8種默認(rèn)測(cè)量程序、精確自定義程序等。
同時(shí)使用熒光光纖氧氣傳感器測(cè)量密閉比色皿里樣品的溶氧濃度。氧氣的測(cè)量可由儀器自帶軟件程序自動(dòng)控制。
放氧測(cè)量過程如下圖所示：在FRR測(cè)量過程中，氧氣濃度隨激發(fā)光變化并與時(shí)間（橫軸）相對(duì)應(yīng)。將氧探頭固定在FL3500自動(dòng)控溫探頭上，一同插入FL3500測(cè)量單元內(nèi)的待測(cè)樣品中。FL3500具有磁力攪拌功能，該功能可由觸控面板控制，也可由FL3500自帶軟件FluorWin程序精確定義。
在初始300s的暗適應(yīng)過程中記錄氧氣濃度作為暗呼吸值；之后用低光（20 µmol.m-2.s-1）進(jìn)行預(yù)光照激活光系統(tǒng)并測(cè)量氧氣；在一個(gè)FRR程序結(jié)束后立刻測(cè)量氧氣濃度作為在FRR過程中的呼吸。二者差值用于估算樣品中[PSII]active含量。
之后將樣品置于光下300 s；再次進(jìn)行FRR誘導(dǎo)（見下圖）并測(cè)量氧濃度。再次估算樣品中[PSII]active含量。公式為：
FRR測(cè)量過程如下圖所示：先進(jìn)行300 μs的暗適應(yīng)。預(yù)光照之后使用40個(gè)（間隔2 μs）單周轉(zhuǎn)光閃（1.2 μs， 65000 µmol.m-2.s-1）的激發(fā)序列進(jìn)行FRR誘導(dǎo)，以逐漸關(guān)閉全部PSII；在這個(gè)過程中得到Fo、FM、σPSII、ρ（表示PSII 光反應(yīng)中心的連通性）。之后降低光閃重復(fù)速率，PSII逐漸打開，此過程持續(xù)0.25 s。黑暗2 s，PSII打開。再施加第二次FRR誘導(dǎo)，得到F’o2、F’M2s、σ’PSII2s…… 
使用放氧法得到的[PSII]active對(duì)FRR得到的 [PSII]active=F’o/σ’PSII 公式進(jìn)行校正，得到校正參數(shù)。
本研究驗(yàn)證了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假設(shè)，應(yīng)用FRR測(cè)量得到的[PSII]active矯正公式適用于本文所述所有藻類樣品，包括：呈指數(shù)增長(zhǎng)的樣品、短期生理波動(dòng)的非穩(wěn)態(tài)樣品、光抑制樣品、低濃度樣品、光適應(yīng)下的樣品，并且受非光化熒光淬滅影響很小。
因此可以用FRR測(cè)量程序來估算湖泊和海洋不斷變化的環(huán)境中的絕對(duì)初級(jí)生產(chǎn)力。
本案例文獻(xiàn)： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.10142
1. 本研究應(yīng)用的FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng):
http://www.eco-tech.com.cn/portal/article/index/id/365.html
FMT150 光氧生物反應(yīng)器為捷克PSI公司生產(chǎn)，北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司為PSI公司在中國的獨(dú)家代理。FMT150容量分為400ml、1000ml、3000ml。另有訂制大型版。
FMT150將生物反應(yīng)器與監(jiān)測(cè)儀器獨(dú)特地結(jié)合在一起，用于淡水、海水藻類和藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）等的模塊化精確光照培養(yǎng)與生理監(jiān)測(cè)。
控制單元：包括電腦與預(yù)裝軟件。用戶自定義程序自動(dòng)改變培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件與測(cè)量參數(shù)。光強(qiáng)、光質(zhì)、溫度和通入氣體的組分與流速都可以精確調(diào)控。恒濁和恒化控制模塊用于自動(dòng)調(diào)控培養(yǎng)基的pH值和濁度�？刂茊卧赏瑫r(shí)控制多臺(tái)FMT150進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn)，保證不同處理實(shí)驗(yàn)間的一致性。
監(jiān)測(cè)單元：包括溶氧、CO2、pH、培養(yǎng)光強(qiáng)、溫度、OD 680、OD 720、以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)Ft、Fo、Fm、Fm′和QY。
2. 本研究應(yīng)用的氧氣實(shí)時(shí)測(cè)量解決方案請(qǐng)咨詢北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司：
http://www.eco-tech.com.cn/portal/article/index/id/177.html
傳統(tǒng)上對(duì)于[PSII]active的測(cè)量：
- 免疫印跡法測(cè)定PSII蛋白復(fù)合體的豐度：
- 放氧法對(duì)[PSII]active含量絕對(duì)值進(jìn)行測(cè)量：
本文將介紹加拿大蒙特愛立森大學(xué)的Campbell教授的研究------應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行[PSII]active含量估算的方法。該方法有效解決了傳統(tǒng)測(cè)量方法存在的問題。其原理是：在一定體積下：
a）F’o強(qiáng)度與[PSII]active色素含量相關(guān)；
b）σ’PSII與PSII色素總含量相關(guān)。
因此，F(xiàn)’o/σ’PSII可以代表單位體積的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而這兩個(gè)參數(shù)都可以利用快速飽和及弛豫熒光誘導(dǎo)程序（fast repletion and relaxation (FRR) fluorescence induction）獲得。（注：σ’PSII: 光適應(yīng)狀態(tài)下PSII的有效吸收截面；F’o：光適應(yīng)下的基礎(chǔ)熒光。）
為了證明該方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化熒光淬滅影響很小、測(cè)量快速并且穩(wěn)定、具有時(shí)間分辨性、可應(yīng)用于對(duì)湖泊和海洋水體的初級(jí)生產(chǎn)力的快速評(píng)估，該研究進(jìn)行了209次成對(duì)測(cè)定，對(duì)不同培養(yǎng)和處理?xiàng)l件下的海洋藍(lán)藻、分別在高光和低光處理下的原生態(tài)型球藻、北極和溫帶的綠藻、兩種中心硅藻進(jìn)行測(cè)試。
由于藻類的生理狀態(tài)對(duì)培養(yǎng)密度、光照條件、氣體狀態(tài)、溫度、pH值等都很敏感，進(jìn)而直接影響所得參數(shù)和公式的科學(xué)性，所以需要精確控制培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)狀態(tài)。因此本研究使用FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器對(duì)中心硅藻兩個(gè)藻株分別在2種不同狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)，精確控制營養(yǎng)濃度、溫度、光照，并自動(dòng)進(jìn)行恒化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中儀器自動(dòng)使用水蒸氣飽和的空氣氣泡混勻，避免沉降。（FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器介紹見后附）
之后使用FL3500（當(dāng)前升級(jí)為FL6000）測(cè)量每個(gè)樣品的F’o和σ’PSII，用以計(jì)算[PSII]active。FL3500可自動(dòng)控制和測(cè)量樣品溫度、預(yù)施光照、光化光、單周轉(zhuǎn)飽和光閃、QA再氧化等8種默認(rèn)測(cè)量程序、精確自定義程序等。
同時(shí)使用熒光光纖氧氣傳感器測(cè)量密閉比色皿里樣品的溶氧濃度。氧氣的測(cè)量可由儀器自帶軟件程序自動(dòng)控制。
放氧測(cè)量過程如下圖所示：在FRR測(cè)量過程中，氧氣濃度隨激發(fā)光變化并與時(shí)間（橫軸）相對(duì)應(yīng)。將氧探頭固定在FL3500自動(dòng)控溫探頭上，一同插入FL3500測(cè)量單元內(nèi)的待測(cè)樣品中。FL3500具有磁力攪拌功能，該功能可由觸控面板控制，也可由FL3500自帶軟件FluorWin程序精確定義。
在初始300s的暗適應(yīng)過程中記錄氧氣濃度作為暗呼吸值；之后用低光（20 µmol.m-2.s-1）進(jìn)行預(yù)光照激活光系統(tǒng)并測(cè)量氧氣；在一個(gè)FRR程序結(jié)束后立刻測(cè)量氧氣濃度作為在FRR過程中的呼吸。二者差值用于估算樣品中[PSII]active含量。
之后將樣品置于光下300 s；再次進(jìn)行FRR誘導(dǎo)（見下圖）并測(cè)量氧濃度。再次估算樣品中[PSII]active含量。公式為：
μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×（25.025×10-3s Flash-1）×(4 Flash 1×1 PSII/O2)
FRR測(cè)量過程如下圖所示：先進(jìn)行300 μs的暗適應(yīng)。預(yù)光照之后使用40個(gè)（間隔2 μs）單周轉(zhuǎn)光閃（1.2 μs， 65000 µmol.m-2.s-1）的激發(fā)序列進(jìn)行FRR誘導(dǎo)，以逐漸關(guān)閉全部PSII；在這個(gè)過程中得到Fo、FM、σPSII、ρ（表示PSII 光反應(yīng)中心的連通性）。之后降低光閃重復(fù)速率，PSII逐漸打開，此過程持續(xù)0.25 s。黑暗2 s，PSII打開。再施加第二次FRR誘導(dǎo)，得到F’o2、F’M2s、σ’PSII2s……
使用放氧法得到的[PSII]active對(duì)FRR得到的 [PSII]active=F’o/σ’PSII 公式進(jìn)行校正，得到校正參數(shù)。
本研究驗(yàn)證了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假設(shè)，應(yīng)用FRR測(cè)量得到的[PSII]active矯正公式適用于本文所述所有藻類樣品，包括：呈指數(shù)增長(zhǎng)的樣品、短期生理波動(dòng)的非穩(wěn)態(tài)樣品、光抑制樣品、低濃度樣品、光適應(yīng)下的樣品，并且受非光化熒光淬滅影響很小。
因此可以用FRR測(cè)量程序來估算湖泊和海洋不斷變化的環(huán)境中的絕對(duì)初級(jí)生產(chǎn)力。
本案例文獻(xiàn)： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.10142
1. 本研究應(yīng)用的FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng):
http://www.eco-tech.com.cn/portal/article/index/id/365.html
FMT150 光氧生物反應(yīng)器為捷克PSI公司生產(chǎn)，北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司為PSI公司在中國的獨(dú)家代理。FMT150容量分為400ml、1000ml、3000ml。另有訂制大型版。
FMT150將生物反應(yīng)器與監(jiān)測(cè)儀器獨(dú)特地結(jié)合在一起，用于淡水、海水藻類和藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）等的模塊化精確光照培養(yǎng)與生理監(jiān)測(cè)。
控制單元：包括電腦與預(yù)裝軟件。用戶自定義程序自動(dòng)改變培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件與測(cè)量參數(shù)。光強(qiáng)、光質(zhì)、溫度和通入氣體的組分與流速都可以精確調(diào)控。恒濁和恒化控制模塊用于自動(dòng)調(diào)控培養(yǎng)基的pH值和濁度�？刂茊卧赏瑫r(shí)控制多臺(tái)FMT150進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn)，保證不同處理實(shí)驗(yàn)間的一致性。
監(jiān)測(cè)單元：包括溶氧、CO2、pH、培養(yǎng)光強(qiáng)、溫度、OD 680、OD 720、以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)Ft、Fo、Fm、Fm′和QY。
2. 本研究應(yīng)用的氧氣實(shí)時(shí)測(cè)量解決方案請(qǐng)咨詢北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司：
http://www.eco-tech.com.cn/portal/article/index/id/177.html
3. 本研究中FRR（該功能須提前訂制）測(cè)量儀器：FL3500 （當(dāng)前已升級(jí)為FL6000）:
http://www.eco-tech.com.cn/portal/search/index.html
http://www.eco-tech.com.cn/portal/search/index.html
FL6000 雙調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x為捷克PSI公司生產(chǎn)，北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司為PSI公司在中國的獨(dú)家代理。有標(biāo)準(zhǔn)版和快速版。本研究應(yīng)用的FRR測(cè)量程序?yàn)榭焖侔嫣峁?br />
具備雙通道測(cè)量控制，一個(gè)通道用于對(duì)藍(lán)綠藻或綠藻等微藻，葉綠體或類囊體懸浮物、葉片碎片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量；另一個(gè)可選擇使用：測(cè)量和控制樣品溫度或者氧氣。此外可選配遠(yuǎn)紅光源（735 nm）、磁力攪拌等功能。
FL6000的測(cè)量單元提供毫秒級(jí)低強(qiáng)度測(cè)量光閃、超短單周轉(zhuǎn)光、以及持續(xù)光化光，三者的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間全部可通過軟件實(shí)現(xiàn)非周期的精確編程控制。檢測(cè)器為500 kHz/16位 AD 轉(zhuǎn)換的PIN二極管信號(hào)檢測(cè)器，測(cè)量葉綠素?zé)晒庑盘?hào)的時(shí)間分辨率可高達(dá)4 µs（快速版為1µs）。AD轉(zhuǎn)換的增益和積分時(shí)間同樣可以通過軟件精確控制。
內(nèi)置測(cè)量程序如下：
應(yīng)用領(lǐng)域：光合自養(yǎng)生物懸浮物生理研究、PSII光化學(xué)效率測(cè)量、水體初級(jí)生產(chǎn)力估算、浮游植物的光合作用和代謝擾動(dòng)、藻華研究、藻類抗脅迫能力或者易感性研究、光合系統(tǒng)工作機(jī)理研究、受脅迫植物光合生理應(yīng)對(duì)策略研究等。
北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司是由科學(xué)家創(chuàng)建并為科學(xué)家提供頂尖科技服務(wù)的高新技術(shù)企業(yè)，是PSI公司在中國的獨(dú)家代理和技術(shù)咨詢服務(wù)中心。易科泰生態(tài)技術(shù)公司在青島、西安設(shè)有分公司，在全國各地設(shè)有辦事處，北京總部設(shè)立有 EcoLab 實(shí)驗(yàn)室以提供實(shí)驗(yàn)研究合作、儀器技術(shù)培訓(xùn)等。
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