如何使用KeyPro污染凈化儀防止RNA的降解和保證PCR的結(jié)果準(zhǔn)確性

瀏覽次數(shù)：2240　發(fā)布日期：2020-2-19　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

在此次的新型冠狀病毒疫情中，核酸檢測(cè)作為確診的金標(biāo)準(zhǔn)發(fā)揮著重要的作用。眾所周知，本次新冠病毒的核酸檢測(cè)流程為采樣（咽拭子、肺泡灌洗液），提取病毒RNA，再經(jīng)過(guò)RT-qPCR或者一步法RT-數(shù)字PCR檢測(cè)樣本。但近期關(guān)于核酸檢測(cè)準(zhǔn)確性的討論也甚囂塵上，其中PCR實(shí)驗(yàn)污染是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)有偏差的原因之一，造成PCR實(shí)驗(yàn)污染的主要原因有以下幾點(diǎn)，樣本間交叉污染（樣本泄漏引起的交叉，樣本提取過(guò)程中移液器、耗材的污染），PCR試劑的污染（容器、耗材、移液器，水等被污染），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染，氣溶膠污染，克隆質(zhì)粒污染等。

在病毒核酸檢測(cè)過(guò)程中，結(jié)果的準(zhǔn)確性除了檢測(cè)方式的靈敏度很重要以外，保證提取RNA樣本的完整性也十分重要。今天我們就聊聊如何防止RNA降解，獲得高質(zhì)量的RNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)就是RNase，RNase非常穩(wěn)定，且無(wú)處不在，用常規(guī)的高溫高壓蒸汽方法和蛋白酶抑制劑不能使所有的RNase完全失活。

RNase結(jié)構(gòu)

除上述方法外，研究人員最常用的就是使用DEPC等對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的耗材和試劑進(jìn)行處理，但DEPC處理時(shí)間長(zhǎng)且有毒，下面給出遠(yuǎn)離DEPC的三大理由：

1、DEPC 對(duì)人體有害，DEPC為高活性烷化試劑，能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)稀釋?zhuān)蛊浣M氨基團(tuán)的乙氧基甲酸化（RNase 活性位點(diǎn)有兩個(gè)組氨基酸，故能被滅活）；同時(shí)能使 RNA 分子中沒(méi)配對(duì)的腺嘌呤羥甲基化，改變其活性，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響 RNA 形成雜交雙鏈的能力，歸為強(qiáng)致癌物，使用時(shí)要十分小心。

2、不能處理一些試劑：例如：一級(jí)胺的試劑TRIS，PBS等，會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；二是不能高壓滅菌的試劑，DTT，dNTP，Mgcl2，因?yàn)?DEPC必須通過(guò)高壓滅菌去除；三是不能用于PH低于4及以下的試劑，DEPC在此條件下對(duì)RNase沒(méi)有滅活作用。

3、DEPC不適合某些實(shí)驗(yàn)，測(cè)OD值的實(shí)驗(yàn)，OD讀數(shù)跟 PH 有關(guān)， DEPC 在溶液中分解后變成乙醇和二氧化碳，部分二氧化碳與水反應(yīng)形成碳酸，導(dǎo)致 PH 降低，進(jìn)而降低OD值。

實(shí)驗(yàn)者迫切需要一種非常快速且方便的去除RNase的方法，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用 KeyPro™KP100生物污染紫外凈化儀，通過(guò)275nm和365nm雙紫外的協(xié)同作用可在5min解除上述污染煩惱。免清洗，無(wú)化學(xué)殘留，方便快捷，適用于高保真 RNA 文庫(kù)制備，測(cè)序和 PCR 實(shí)驗(yàn)室中的微孔板去污、移液器、水、金屬、陶瓷、塑料、玻璃等表面RNase的滅活等。同時(shí)KeyPro™KP100還可以去除病毒和細(xì)菌等的污染，防止實(shí)驗(yàn)用品導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和環(huán)境污染。