一種無酚/無氯仿組織研磨從熱帶木本植物中提取核酸的方法
概述：
木本熱帶植物中含有大量復(fù)雜的有機(jī)化合物，這些有機(jī)化合物會抑制提取RNA或DNA所需的化學(xué)程序，從而不利于后續(xù)研究及應(yīng)用，如RNA測序和基因表達(dá)分析。為了克服這個問題，研究人員必須使用CTAB / PVP緩沖液的提取方案，而不能使用市售的DNA / RNA提取試劑盒。但是，這種提取方式耗時長、需使用有毒化學(xué)品（例如苯酚和氯仿），并且一次只能處理少量樣品。為了克服這些問題，我們開發(fā)了一種基于CTAB / PVP的新方法，用于RNA或DNA提取，去掉了傳統(tǒng)方法中的苯酚/氯仿步驟。此外，該方法同樣適用于96孔深孔板，使用SPEX高通量組織研磨儀，一次研磨6塊深孔板，同時處理576個樣品，大大加快了處理速度。
我們的新方法，能夠從夏威夷果、牛油果和芒果組織中，成功提取RNA，這些組織使用傳統(tǒng)方法很難提取到RNA。而后我們還驗證了，該方法提取的RNA成功地合成cDNA，以進(jìn)行實時定量PCR并生成高質(zhì)量的RNA-Seq庫。該方法經(jīng)輕微改動后，可用于從不同的熱帶和亞熱帶樹種中快速提取DNA。
這種方法可以更安全、更快速地從困難樣品中提取DNA和RNA，從而為將來在熱帶樹木上的研究提供了便利。
正文：
一、背景
分子實驗揭示了植物物種的生理遺傳結(jié)構(gòu)和功能，使種植者能夠在不斷變化的環(huán)境條件下提高生產(chǎn)力。然而，從植物中提取的RNA或DNA的傳統(tǒng)方法中，使用的是草本植物（如擬南芥），但這種方法并不能很好地使用在某些植物種類上。例如，熱帶樹木的組織中含有的多糖和多酚類物質(zhì)，會阻礙傳統(tǒng)方法中核酸的提取。從這些物種中提取RNA或DNA通常依賴于使用苯酚和氯仿，但它們易揮發(fā)、毒性強(qiáng)，如果研究人員的經(jīng)常使用，危害很大，是不適合作為常規(guī)方法的。因此，我們試圖通過摸索更安全、更快速的方法，來改善熱帶樹木中RNA或DNA的提取實驗。
在本項研究中，我們開發(fā)并測試了一種從熱帶/亞熱帶木本植物的各部分組織中提取DNA和總RNA（包括小RNA）的新方法，包括牛油果（Persea americana L.），夏威夷果（Macadamia integrifolia L.）和芒果（Mangifera indica L.）。我們的方法不需要苯酚或氯仿，可在不到1天的時間內(nèi)，在96孔板中提取96個樣品�？梢詫λ玫腞NA進(jìn)行測序，并用于產(chǎn)生高質(zhì)量的RNA-Seq讀數(shù)。DNA提取方法還可以用于咖啡樹（Coffea arabica L.）和桉樹（Eucalyptus grandis L.）。該方法將有助于對熱帶樹木進(jìn)行新穎的分子研究，這在以前，對其進(jìn)行大規(guī)模遺傳調(diào)查和實驗非常困難。
二、材料和方法
1、植物材料和組織研磨
從田間種植的牛油果樹中收集了多種組織樣本。哈斯·芒果品種：1243，夏威夷果品種：751，澳大利亞昆士蘭州的咖啡和桉樹。所有樹木都已成熟（8至15歲）。從成熟葉片中提取DNA，而在莖，葉，根，花和腋芽組織上進(jìn)行RNA提取。擬南芥品種：Columbia-0，豌豆品種：Torsdag，用于評估該方法對草本植物的有效性。
將新鮮樣品在液氮或干冰中速凍，并在研磨成粉末（均質(zhì)）之前，在-80°C下儲存。冷凍的樣品進(jìn)行研磨，使用自動組織研磨儀（Geno /Grinder®2010，SPEX高通量組織研磨儀）。將葉、芽、花和根樣品在2 ml樣品管中研磨（每次最多96個樣品），將莖組織在15 ml樣品管中研磨（每次最多12個）。冷凍樣品以1750 rpm的速度研磨1min，而后在−80°C的溫度下冷凍30分鐘，然后再循環(huán)破碎一或兩次。使用刮刀將提取所需的粉末量（根據(jù)初步評估的體積/重量）轉(zhuǎn)移到新的試管中。
2、溶液和試劑
3、RNA提取
組織裂解
將0.5–50 mg（不用更多）的研磨樣品轉(zhuǎn)移到2 ml試管中。
加入625 µl CTAB緩沖液和25 µl DTT 0.5 mM（使用前將其混合）。
充分渦旋并在60°C下培養(yǎng)15分鐘，每5分鐘渦旋一次。
僅適用于困難樣品：添加65 µl SDS 10％，并充分渦旋（如果只有少量組織，則僅添加40 µl SDS 10％） 注意：在此階段，SDS與CTAB一起沉淀，使樣品渾濁。
在室溫下以20,000 g離心15分鐘。 注意：組織碎片將在試管底部沉淀，SDS / CTAB將在表面形成半固體層。
從離心機(jī)中小心地移出試管，并將550–600 µl液相轉(zhuǎn)移到新的2 ml管中或轉(zhuǎn)移到96孔板中，然后進(jìn)行核酸沉淀。 注意：1、如果錯誤地吸收了太多的頂層，請將樣品放入新的2 ml試管中，然后重復(fù)此步驟（提示：第二次離心后，直接從試管的底部吸取樣品，頂層會粘在移液槍的槍頭的外側(cè)）。 2、根據(jù)組織的不同，可能會形成不同的沉淀物（牛油果的芽就是這種情況）。此時轉(zhuǎn)移到過濾柱（Qiagen QIAshredder或Macherey–Nagel NucleoSpin過濾器）中，而不是2 ml管中，并重復(fù)此步驟。
核酸沉淀
在每個管、深孔板孔、渦旋孔中加入550 µl預(yù)冷（-20°C）的異丙醇
在-20°C下放置15min。注意：在此階段，您可以將樣品在-20°C下放置幾天或幾周
樣品管、深孔板在4℃下離心，深孔板1小時、3100g，樣品管45分鐘 20,000g。
傾斜管/板以除去異丙醇
加入1mL70％乙醇
在4°C下度離心10-15min（3100 g對深孔板，20,000 g對離心管）
傾斜管/板以除去乙醇
對深孔板/樣品管短暫離心，并用移液管除去殘留的乙醇
讓樣品在工作臺上干燥10分鐘。
DNase 處理
加入175 µl無RNase的水，上下吸勻，重懸沉淀
將深孔板在50–60°C下放置2–3分鐘，快速渦旋
每個樣品管或深孔板每個孔加入20 µl DNase和5 µl DNase I混合液（提前混合好的）。
快速渦旋，快速旋轉(zhuǎn)并在37°C下培養(yǎng)20–30分鐘
立即進(jìn)行下一步。
RNA沉淀和洗脫
在每個管/孔中加入200 µl預(yù)冷（-20°C）異丙醇并渦旋孔
在-20°C下放置15min（注：在此階段，您也可以將樣品在-20°C下放置幾天）
深孔板在3100 g、4°C離心1 h，樣品管在20,000 g、4°C離心45 min
傾斜樣品管/深孔板以除去異丙醇
加入1mL70％乙醇
在4°C下離心10-15分鐘（對于深孔板3100g，對于樣品管20000g）
傾斜樣品管/深孔板以去除乙醇
短暫離心，并用移液槍除去殘留的乙醇
讓樣品在工作臺上干燥10min
加入40–100 µl溫的（60°C）不含RNase的水，并用力上下吸勻
快速渦旋
通過凝膠電泳和分光光度法確定RNA的數(shù)量和質(zhì)量，并將樣品保存在-80°C。
4、DNA提取
組織裂解和RNase處理
將最多50 mg的初始樣品轉(zhuǎn)移到2 ml樣品管中
加入400 µl CTAB緩沖液和4 µl RNase A + RNase緩沖液（如前所述提前混合好的）
37°C下充分渦旋1h，并每15分鐘反轉(zhuǎn)一次
加入30 µl 10％的 SDS，并充分渦旋（如果使用少量組織（<10–15 mg），則僅添加15 µl 10％的SDS）。（注意：SDS與CTAB一起沉淀，使樣品渾濁）
在室溫下以20,000 g離心15分鐘。（注意：組織碎片將在試管底部沉淀，SDS / CTAB將在表面形成半固體層）
從離心機(jī)中小心取出，并將350–400 µl上清液轉(zhuǎn)移到新的2 ml樣品管中或2 ml 96孔板中，進(jìn)行核酸沉淀。（注意：1、如果錯誤地吸收了太多的頂層，請將樣品放入新的2 ml試管中，然后重復(fù)此步驟（提示：第二次離心后，直接從試管的底部吸取樣品（頂層會粘在槍頭的外側(cè)）。2、視組織而異，如果形成臟/不清晰的沉淀物（牛油果的芽就是這種情況），需轉(zhuǎn)移到過濾柱（Qiagen QIAshredder或Macherey-Nagel NucleoSpin過濾器）中，而不是2 ml試管中，然后重復(fù)此操作步。）
DNA沉淀和洗脫
向每個樣品管/深孔板孔和渦旋孔中加入350-400 µl預(yù)冷（-20°C）的異丙醇
在-20°C下放置15min（注意：在此階段，您也可以將樣品在-20°C下放置幾天）
4℃下離心，深孔板：3100g、1小時，樣品管： 20,000g、45min
傾斜樣品管/深孔板以除去異丙醇
加入70％乙醇1mL
在4°C下以3100 g的速度離心10-15min（對于深孔板）或20,000 g（對于離心管）
傾斜樣品管/深孔板以除去乙醇
快速離心樣品管/深孔板，并用移液槍除去殘留的乙醇
讓樣品在工作臺上干燥10min
加入90 µl溫的（60°C）的無RNase的水，上下吸勻并充分渦旋以重懸沉淀。
5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與質(zhì)量控制
通過在1.1％瓊脂糖凝膠上電泳RNA或DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。核酸通過加入Red Sage染色®到凝膠。使用Gel Doc™系統(tǒng)（美國加利福尼亞州的Bio-Rad實驗室）進(jìn)行凝膠可視化。用NanoVue™ Plus分光光度計（GE Healthcare Life Sciences，賓夕法尼亞州，美國）測定樣品的質(zhì)量和純度，測量RNA在280 nm和DNA在260nm的吸光度。
6、cDNA合成和定量實時PCR（qRT-PCR）
對于qRT-PCR，按照生產(chǎn)商的說明，通過在8 µl和2 µl的5×iScript Supermix（美國加利福尼亞Bio-Rad實驗室）中使用250–500 ng的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后將cDNA稀釋至每微升超純水中0.5 ng當(dāng)量RNA，用于工作模板溶液。然后定量實時PCR，每個反應(yīng)試劑盒使用2微升的1mM的引物混合物，5μl cDNA和3μl SensiFAST™SYBR ®No-ROX Kit（Bioline）。按照生產(chǎn)商的說明擴(kuò)增樣品，并使用CFX384 Touch™實時PCR檢測系統(tǒng)（美國加利福尼亞州Bio-Rad實驗室）檢測熒光。
7、cDNA合成和miRNA表達(dá)定量
為了定量miRNA的表達(dá)，按照生產(chǎn)商的說明，使用miScript Plant RT Kit（Qiagen，荷蘭）試劑盒，通過連接反轉(zhuǎn)錄介質(zhì)，從100到200 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄合成低分子量cDNA。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用超純水稀釋制備的cDNA，以實現(xiàn)最佳擴(kuò)增。所述的qRT-PCR反應(yīng)按照生產(chǎn)商的說明書（miScript SYBR Green PCR試劑盒，Qiagen，荷蘭）進(jìn)行使用：10μl的1×QuantiTect SYBR ®綠色主混合物，2微升1×miScript通用引物，2μl的0.8μM的miRNA特異性引物和2 µl模板cDNA。進(jìn)行qRT-PCR運(yùn)行，并使用Rotor-Gene Q 6000（Qiagen，荷蘭）測量熒光。
8、RNA-Seq庫的制備和測序
如Kerr等人所述制備RNA庫的方式，準(zhǔn)備牛油果、夏威夷果和芒果的莖、葉、根、花和腋芽組織。然后按照生產(chǎn)商的說明（Evrogen JSC，莫斯科，俄羅斯）使用Trimmer-2 cDNA標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒對cDNA庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用CFX96 Touch™實時PCR檢測系統(tǒng)（美國加利福尼亞Bio-Rad實驗室），使用Illumina測序平臺的庫定量試劑盒（KAPA Biosystems，美國波士頓），通過qRT-PCR對庫進(jìn)行定量。使用從qRT-PCR計算的摩爾濃度將庫標(biāo)準(zhǔn)化為4 nM的工作濃度，并調(diào)整片段大小。然后使用Illumina測序儀（NextSeq）對RNA-Seq樣本進(jìn)行測序。
9、RNA-Seq讀取質(zhì)量控制評估和定位
Trimmomtatic v. 0.35 用于去除啟動子，根據(jù)質(zhì)量修剪和過濾讀取結(jié)果。使用Deconseq v. 0.4.2，從讀取結(jié)果中去除序列污染物。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）檢查序列讀取質(zhì)量。
為了驗證我們的RNA測序結(jié)果，我們將讀段映射到已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組和基因組序列草案中。使用HISAT v.2（默認(rèn)設(shè)置）將修剪的讀取結(jié)果映射到已發(fā)布的參考轉(zhuǎn)錄組和基因組序列中。
三、結(jié)果
1、無苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based RNA提取
在下面介紹的第一批實驗中，我們開發(fā)并測試了一種使用40-60 mg牛油果、夏威夷果和芒果成熟葉片的冷凍葉組織提取RNA的方法。在發(fā)表的文獻(xiàn)中，用于困難樹種開發(fā)的大多數(shù)RNA提取方法，通過使用CTAB / PVP裂解緩沖液中調(diào)高鹽（NaCl）濃度，可以提高RNA產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，我們使用該緩沖液裂解我們的樣品。大多數(shù)提取方法都使用此緩沖液來提取RNA，同時聯(lián)合使用苯酚/氯仿法從蛋白質(zhì)中分離出核酸。但是，我們不使用苯酚和氯仿，因為它們具有毒性，同時它們不可能在96孔板中實現(xiàn)高通量。因此，我們決定通過加入一定量的異丙醇，并在裂解步驟后離心樣品，來得到RNA沉淀（圖1）。在這個階段，蛋白質(zhì)和不需要的化合物（如多糖和多酚）會溶解在上清液中，并且很容易可以除去。用乙醇洗滌沉淀后，將核酸重懸，并進(jìn)行DNase處理，然后在異丙醇中進(jìn)行另一輪沉淀并洗脫以回收RNA。圖2中的質(zhì)量控制顯示RNA未被降解，并且260/280的比率高于1.79，表明提取過程中蛋白質(zhì)被去除。260/230的比例在1.2至1.56之間，具體取決于物種，這表明殘留了一些多糖。
為了改進(jìn)方法，在60°培養(yǎng)步驟后將1％SDS添加到裂解緩沖液中。SDS是一種清潔劑，可幫助消化細(xì)胞膜并在此步驟中釋放更多核酸。SDS還具有破壞核酸/蛋白質(zhì)相互作用，并促進(jìn)CTAB /核酸復(fù)合物溶解的特性，從而改善了核酸的沉淀并提高了產(chǎn)量。用SDS本身提取的樣品獲得的RNA產(chǎn)量比CTAB / PVP緩沖液更好。但是，260/230的比例非常低（1.07），無法防止樣品氧化（圖3a）。結(jié)合CTAB和SDS方法來改善產(chǎn)率（圖2、3）。這在夏威夷果中尤為明顯，其RNA產(chǎn)量幾乎翻了一番。如通過裂解步驟后的樣品顏色觀察（圖 3a），CTAB / PVP和SDS的組合也抑制了樣品氧化和葉綠素變性，這是SDS的已知作用。CTAB和SDS之間的相互作用形成微膠束，產(chǎn)生可見的混濁沉淀，導(dǎo)致離心后在緩沖液和空氣之間界面處形成半固體白色層。
因沒有CTAB或樣品管中有植物組織，SDS對產(chǎn)量的影響并未降低（圖3）。這表明在該方法中，SDS對產(chǎn)量的影響可能是由于其從核酸中分離蛋白質(zhì)的能力，而不是其組織裂解活性或其溶解CTAB /核酸復(fù)合物的性質(zhì)。此外，添加SDS還可略微提高牛油果和夏威夷果的260/230比例，這表明CTAB和SDS的組合可在最終洗脫過程中稍微降低多糖含量（圖3）。
2、從不同組織類型中提取RNA
然后，我們測試了該方法對于不同類型的組織是否有效。為了測試這一點，我們使用15–30 mg的四種不同夏威夷果組織（葉、莖、花、腋芽）進(jìn)行了相同的步驟。質(zhì)量/數(shù)量控制表明，該方法對夏威夷果的這四種組織類型均有效（圖4）。還對根組織進(jìn)行了測試，但結(jié)果不一致，不能認(rèn)為是成功的（數(shù)據(jù)不包括在內(nèi)）。從莖和休眠腋芽中提取的RNA量要少于從葉和花中提取的RNA，這可能是由于這種組織中所含的活細(xì)胞數(shù)量較少。對于所有組織，260/280均高于1.79，表明蛋白質(zhì)已從樣品中有效去除。260/230比值較低，這可能是由于這些組織類型中包含大量次要化合物。
3、使用96深孔板提取RNA
我們希望能開發(fā)一種可以同時提取大批量樣本的方法。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，我們注意到該方法的一個特點：在裂解步驟之后，該方法不需要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行移液，不像使用苯酚和氯仿的方法一樣。因此，我們在2 ml 96深孔板上使用與樣品管進(jìn)行相同的步驟。與樣品管結(jié)果相比，使用深孔板提取的結(jié)果令人滿意，可以在圖5中所示的質(zhì)量控制結(jié)果看出。且使用96深孔板方法，僅需一天即可提取96個樣品（不包括研磨時間），而使用96通道的移液器（PLATEMASTER，Gilson）可以使花費(fèi)的時間更短。
4、實時定量PCR和RNA-Seq讀取質(zhì)量控制
為了證明提取方法所產(chǎn)生的RNA質(zhì)量足夠好，我們使用RNA進(jìn)行實時定量PCR和RNA測序。用DORMANCY1（DRM1）和miR172在三種樹種中獲得的擴(kuò)增（圖 6）和解鏈曲線（附加文件1：圖S1）證明，RNA可成功用于定量RT-PCR（圖 6）。這些結(jié)果表明，即使在某些樣品中260/230比值不是最佳的，用這種方法分離的RNA的質(zhì)量也足以進(jìn)行基因和miRNA定量分析。
為了進(jìn)一步證明我們的RNA提取方法的適用性，我們使用該方法為牛油果、夏威夷果和芒果樹中的每一種樣品制備標(biāo)準(zhǔn)化的RNA-Seq庫，并使用Illumina測序技術(shù)對其進(jìn)行了測序。使用此方法獲得的基因庫質(zhì)量控制數(shù)據(jù)表明，使用本文所述方法提取的RNA質(zhì)量很好，完全滿足RNA提取實驗要求（圖 7和附加文件2：圖S2）。在使用Trimmomatic進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)修整和質(zhì)量控制后，使用FastQC版本0.11.5（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）進(jìn)行質(zhì)量評估，數(shù)據(jù)表明質(zhì)量良好（圖7），且具有統(tǒng)一的高質(zhì)量堿基調(diào)用，以讀取正向（圖 7）和反向（附加文件2：圖S2）序列的末尾。這說明大多數(shù)序列讀數(shù)均為高質(zhì)量，這為后續(xù)的遺傳分析提供了保障。
5、序列映射檢測
為了驗證我們的RNA測序，我們使用HISAT v.2（默認(rèn)設(shè)置）將修飾后的序列映射到已發(fā)布的轉(zhuǎn)錄組和基因組序列中（如表1）。我們牛油果樣品中有76％和80％的讀段映射到Persea americana var'drymifolia' and cv. ‘ Lisa’轉(zhuǎn)錄組序列集中。我們芒果樣品的讀段中有66％和69％映射到印度芒果（Mangifera indica L. cv. 'Shelly' and 'Zill'轉(zhuǎn)錄組序列集中。我們夏威夷果樣品中有79％的讀斷映射到夏威夷果Madamadia integrifolia cv. 741 ‘Mauka’基因組序列集草案中。這種質(zhì)量控制進(jìn)一步支持了用我們的方法提取的RNA的質(zhì)量足以進(jìn)行各種轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。
6、無苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based DNA提取
對樹木進(jìn)行DNA提取方法時通常遇到的問題與RNA提取方法相同。因此，我們決定測試這種RNA提取方法是否可以轉(zhuǎn)換為基因組DNA提取方法。為實現(xiàn)此目的，我們通過用RNase代替CTAB緩沖液中的DTT來修改方法，以在裂解步驟中去除RNA。對于RNA提取，在裂解步驟結(jié)束時添加1％的SDS，并執(zhí)行一次沉淀/洗滌/洗脫循環(huán)以回收純化的DNA（圖8）。我們的樣品還包括來自室外種植的咖啡樹和桉樹的成熟葉片樣品，這兩個物種在DNA提取方面眾所周知是有挑戰(zhàn)性的。圖9所示的是質(zhì)量和數(shù)量控制結(jié)果，圖示表明，所獲得的提取量令人滿意，并且提取的DNA沒有降解。因此證明，該方法可以轉(zhuǎn)化為困難的熱帶和亞熱帶物種樣品的DNA提取方法。
四、結(jié)論
在過去的十年中，轉(zhuǎn)錄組測序的價格已大大降低，促使研究人員設(shè)計更大規(guī)模的實驗。但是，用于木質(zhì)熱帶物種的核酸提取的化學(xué)藥品的毒性和不實用性，是這些樣品進(jìn)行大規(guī)模實驗主要面臨的問題。我們在此描述的方法可以降低這些問題的影響，并將促使人們進(jìn)行更多大規(guī)模的實驗，以便于研究在分子生物學(xué)中被認(rèn)為是困難的物種。
木本熱帶植物中含有大量復(fù)雜的有機(jī)化合物，這些有機(jī)化合物會抑制提取RNA或DNA所需的化學(xué)程序，從而不利于后續(xù)研究及應(yīng)用，如RNA測序和基因表達(dá)分析。為了克服這個問題，研究人員必須使用CTAB / PVP緩沖液的提取方案，而不能使用市售的DNA / RNA提取試劑盒。但是，這種提取方式耗時長、需使用有毒化學(xué)品（例如苯酚和氯仿），并且一次只能處理少量樣品。為了克服這些問題，我們開發(fā)了一種基于CTAB / PVP的新方法，用于RNA或DNA提取，去掉了傳統(tǒng)方法中的苯酚/氯仿步驟。此外，該方法同樣適用于96孔深孔板，使用SPEX高通量組織研磨儀，一次研磨6塊深孔板，同時處理576個樣品，大大加快了處理速度。
我們的新方法，能夠從夏威夷果、牛油果和芒果組織中，成功提取RNA，這些組織使用傳統(tǒng)方法很難提取到RNA。而后我們還驗證了，該方法提取的RNA成功地合成cDNA，以進(jìn)行實時定量PCR并生成高質(zhì)量的RNA-Seq庫。該方法經(jīng)輕微改動后，可用于從不同的熱帶和亞熱帶樹種中快速提取DNA。
這種方法可以更安全、更快速地從困難樣品中提取DNA和RNA，從而為將來在熱帶樹木上的研究提供了便利。
正文：
一、背景
分子實驗揭示了植物物種的生理遺傳結(jié)構(gòu)和功能，使種植者能夠在不斷變化的環(huán)境條件下提高生產(chǎn)力。然而，從植物中提取的RNA或DNA的傳統(tǒng)方法中，使用的是草本植物（如擬南芥），但這種方法并不能很好地使用在某些植物種類上。例如，熱帶樹木的組織中含有的多糖和多酚類物質(zhì)，會阻礙傳統(tǒng)方法中核酸的提取。從這些物種中提取RNA或DNA通常依賴于使用苯酚和氯仿，但它們易揮發(fā)、毒性強(qiáng)，如果研究人員的經(jīng)常使用，危害很大，是不適合作為常規(guī)方法的。因此，我們試圖通過摸索更安全、更快速的方法，來改善熱帶樹木中RNA或DNA的提取實驗。
在本項研究中，我們開發(fā)并測試了一種從熱帶/亞熱帶木本植物的各部分組織中提取DNA和總RNA（包括小RNA）的新方法，包括牛油果（Persea americana L.），夏威夷果（Macadamia integrifolia L.）和芒果（Mangifera indica L.）。我們的方法不需要苯酚或氯仿，可在不到1天的時間內(nèi)，在96孔板中提取96個樣品�？梢詫λ玫腞NA進(jìn)行測序，并用于產(chǎn)生高質(zhì)量的RNA-Seq讀數(shù)。DNA提取方法還可以用于咖啡樹（Coffea arabica L.）和桉樹（Eucalyptus grandis L.）。該方法將有助于對熱帶樹木進(jìn)行新穎的分子研究，這在以前，對其進(jìn)行大規(guī)模遺傳調(diào)查和實驗非常困難。
二、材料和方法
1、植物材料和組織研磨
從田間種植的牛油果樹中收集了多種組織樣本。哈斯·芒果品種：1243，夏威夷果品種：751，澳大利亞昆士蘭州的咖啡和桉樹。所有樹木都已成熟（8至15歲）。從成熟葉片中提取DNA，而在莖，葉，根，花和腋芽組織上進(jìn)行RNA提取。擬南芥品種：Columbia-0，豌豆品種：Torsdag，用于評估該方法對草本植物的有效性。
將新鮮樣品在液氮或干冰中速凍，并在研磨成粉末（均質(zhì)）之前，在-80°C下儲存。冷凍的樣品進(jìn)行研磨，使用自動組織研磨儀（Geno /Grinder®2010，SPEX高通量組織研磨儀）。將葉、芽、花和根樣品在2 ml樣品管中研磨（每次最多96個樣品），將莖組織在15 ml樣品管中研磨（每次最多12個）。冷凍樣品以1750 rpm的速度研磨1min，而后在−80°C的溫度下冷凍30分鐘，然后再循環(huán)破碎一或兩次。使用刮刀將提取所需的粉末量（根據(jù)初步評估的體積/重量）轉(zhuǎn)移到新的試管中。
2、溶液和試劑
- CTAB緩沖液：CTAB 2%，NaCl 1.4M，EDTA 20 mM，Tris–HCl 100 mM，PVP40 2％
- 異丙醇100％
- DTT（DL-二硫蘇糖醇）0.5 mM
- SDS 10％
- 70％乙醇
- DNase Ⅰ+ DNase緩沖液
- RNase A
3、RNA提取
組織裂解
將0.5–50 mg（不用更多）的研磨樣品轉(zhuǎn)移到2 ml試管中。
加入625 µl CTAB緩沖液和25 µl DTT 0.5 mM（使用前將其混合）。
充分渦旋并在60°C下培養(yǎng)15分鐘，每5分鐘渦旋一次。
僅適用于困難樣品：添加65 µl SDS 10％，并充分渦旋（如果只有少量組織，則僅添加40 µl SDS 10％） 注意：在此階段，SDS與CTAB一起沉淀，使樣品渾濁。
在室溫下以20,000 g離心15分鐘。 注意：組織碎片將在試管底部沉淀，SDS / CTAB將在表面形成半固體層。
從離心機(jī)中小心地移出試管，并將550–600 µl液相轉(zhuǎn)移到新的2 ml管中或轉(zhuǎn)移到96孔板中，然后進(jìn)行核酸沉淀。 注意：1、如果錯誤地吸收了太多的頂層，請將樣品放入新的2 ml試管中，然后重復(fù)此步驟（提示：第二次離心后，直接從試管的底部吸取樣品，頂層會粘在移液槍的槍頭的外側(cè)）。 2、根據(jù)組織的不同，可能會形成不同的沉淀物（牛油果的芽就是這種情況）。此時轉(zhuǎn)移到過濾柱（Qiagen QIAshredder或Macherey–Nagel NucleoSpin過濾器）中，而不是2 ml管中，并重復(fù)此步驟。
核酸沉淀
在每個管、深孔板孔、渦旋孔中加入550 µl預(yù)冷（-20°C）的異丙醇
在-20°C下放置15min。注意：在此階段，您可以將樣品在-20°C下放置幾天或幾周
樣品管、深孔板在4℃下離心，深孔板1小時、3100g，樣品管45分鐘 20,000g。
傾斜管/板以除去異丙醇
加入1mL70％乙醇
在4°C下度離心10-15min（3100 g對深孔板，20,000 g對離心管）
傾斜管/板以除去乙醇
對深孔板/樣品管短暫離心，并用移液管除去殘留的乙醇
讓樣品在工作臺上干燥10分鐘。
DNase 處理
加入175 µl無RNase的水，上下吸勻，重懸沉淀
將深孔板在50–60°C下放置2–3分鐘，快速渦旋
每個樣品管或深孔板每個孔加入20 µl DNase和5 µl DNase I混合液（提前混合好的）。
快速渦旋，快速旋轉(zhuǎn)并在37°C下培養(yǎng)20–30分鐘
立即進(jìn)行下一步。
RNA沉淀和洗脫
在每個管/孔中加入200 µl預(yù)冷（-20°C）異丙醇并渦旋孔
在-20°C下放置15min（注：在此階段，您也可以將樣品在-20°C下放置幾天）
深孔板在3100 g、4°C離心1 h，樣品管在20,000 g、4°C離心45 min
傾斜樣品管/深孔板以除去異丙醇
加入1mL70％乙醇
在4°C下離心10-15分鐘（對于深孔板3100g，對于樣品管20000g）
傾斜樣品管/深孔板以去除乙醇
短暫離心，并用移液槍除去殘留的乙醇
讓樣品在工作臺上干燥10min
加入40–100 µl溫的（60°C）不含RNase的水，并用力上下吸勻
快速渦旋
通過凝膠電泳和分光光度法確定RNA的數(shù)量和質(zhì)量，并將樣品保存在-80°C。
4、DNA提取
組織裂解和RNase處理
將最多50 mg的初始樣品轉(zhuǎn)移到2 ml樣品管中
加入400 µl CTAB緩沖液和4 µl RNase A + RNase緩沖液（如前所述提前混合好的）
37°C下充分渦旋1h，并每15分鐘反轉(zhuǎn)一次
加入30 µl 10％的 SDS，并充分渦旋（如果使用少量組織（<10–15 mg），則僅添加15 µl 10％的SDS）。（注意：SDS與CTAB一起沉淀，使樣品渾濁）
在室溫下以20,000 g離心15分鐘。（注意：組織碎片將在試管底部沉淀，SDS / CTAB將在表面形成半固體層）
從離心機(jī)中小心取出，并將350–400 µl上清液轉(zhuǎn)移到新的2 ml樣品管中或2 ml 96孔板中，進(jìn)行核酸沉淀。（注意：1、如果錯誤地吸收了太多的頂層，請將樣品放入新的2 ml試管中，然后重復(fù)此步驟（提示：第二次離心后，直接從試管的底部吸取樣品（頂層會粘在槍頭的外側(cè)）。2、視組織而異，如果形成臟/不清晰的沉淀物（牛油果的芽就是這種情況），需轉(zhuǎn)移到過濾柱（Qiagen QIAshredder或Macherey-Nagel NucleoSpin過濾器）中，而不是2 ml試管中，然后重復(fù)此操作步。）
DNA沉淀和洗脫
向每個樣品管/深孔板孔和渦旋孔中加入350-400 µl預(yù)冷（-20°C）的異丙醇
在-20°C下放置15min（注意：在此階段，您也可以將樣品在-20°C下放置幾天）
4℃下離心，深孔板：3100g、1小時，樣品管： 20,000g、45min
傾斜樣品管/深孔板以除去異丙醇
加入70％乙醇1mL
在4°C下以3100 g的速度離心10-15min（對于深孔板）或20,000 g（對于離心管）
傾斜樣品管/深孔板以除去乙醇
快速離心樣品管/深孔板，并用移液槍除去殘留的乙醇
讓樣品在工作臺上干燥10min
加入90 µl溫的（60°C）的無RNase的水，上下吸勻并充分渦旋以重懸沉淀。
5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與質(zhì)量控制
通過在1.1％瓊脂糖凝膠上電泳RNA或DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。核酸通過加入Red Sage染色®到凝膠。使用Gel Doc™系統(tǒng)（美國加利福尼亞州的Bio-Rad實驗室）進(jìn)行凝膠可視化。用NanoVue™ Plus分光光度計（GE Healthcare Life Sciences，賓夕法尼亞州，美國）測定樣品的質(zhì)量和純度，測量RNA在280 nm和DNA在260nm的吸光度。
6、cDNA合成和定量實時PCR（qRT-PCR）
對于qRT-PCR，按照生產(chǎn)商的說明，通過在8 µl和2 µl的5×iScript Supermix（美國加利福尼亞Bio-Rad實驗室）中使用250–500 ng的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后將cDNA稀釋至每微升超純水中0.5 ng當(dāng)量RNA，用于工作模板溶液。然后定量實時PCR，每個反應(yīng)試劑盒使用2微升的1mM的引物混合物，5μl cDNA和3μl SensiFAST™SYBR ®No-ROX Kit（Bioline）。按照生產(chǎn)商的說明擴(kuò)增樣品，并使用CFX384 Touch™實時PCR檢測系統(tǒng)（美國加利福尼亞州Bio-Rad實驗室）檢測熒光。
7、cDNA合成和miRNA表達(dá)定量
為了定量miRNA的表達(dá)，按照生產(chǎn)商的說明，使用miScript Plant RT Kit（Qiagen，荷蘭）試劑盒，通過連接反轉(zhuǎn)錄介質(zhì)，從100到200 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄合成低分子量cDNA。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用超純水稀釋制備的cDNA，以實現(xiàn)最佳擴(kuò)增。所述的qRT-PCR反應(yīng)按照生產(chǎn)商的說明書（miScript SYBR Green PCR試劑盒，Qiagen，荷蘭）進(jìn)行使用：10μl的1×QuantiTect SYBR ®綠色主混合物，2微升1×miScript通用引物，2μl的0.8μM的miRNA特異性引物和2 µl模板cDNA。進(jìn)行qRT-PCR運(yùn)行，并使用Rotor-Gene Q 6000（Qiagen，荷蘭）測量熒光。
8、RNA-Seq庫的制備和測序
如Kerr等人所述制備RNA庫的方式，準(zhǔn)備牛油果、夏威夷果和芒果的莖、葉、根、花和腋芽組織。然后按照生產(chǎn)商的說明（Evrogen JSC，莫斯科，俄羅斯）使用Trimmer-2 cDNA標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒對cDNA庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用CFX96 Touch™實時PCR檢測系統(tǒng)（美國加利福尼亞Bio-Rad實驗室），使用Illumina測序平臺的庫定量試劑盒（KAPA Biosystems，美國波士頓），通過qRT-PCR對庫進(jìn)行定量。使用從qRT-PCR計算的摩爾濃度將庫標(biāo)準(zhǔn)化為4 nM的工作濃度，并調(diào)整片段大小。然后使用Illumina測序儀（NextSeq）對RNA-Seq樣本進(jìn)行測序。
9、RNA-Seq讀取質(zhì)量控制評估和定位
Trimmomtatic v. 0.35 用于去除啟動子，根據(jù)質(zhì)量修剪和過濾讀取結(jié)果。使用Deconseq v. 0.4.2，從讀取結(jié)果中去除序列污染物。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）檢查序列讀取質(zhì)量。
為了驗證我們的RNA測序結(jié)果，我們將讀段映射到已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組和基因組序列草案中。使用HISAT v.2（默認(rèn)設(shè)置）將修剪的讀取結(jié)果映射到已發(fā)布的參考轉(zhuǎn)錄組和基因組序列中。
三、結(jié)果
1、無苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based RNA提取
在下面介紹的第一批實驗中，我們開發(fā)并測試了一種使用40-60 mg牛油果、夏威夷果和芒果成熟葉片的冷凍葉組織提取RNA的方法。在發(fā)表的文獻(xiàn)中，用于困難樹種開發(fā)的大多數(shù)RNA提取方法，通過使用CTAB / PVP裂解緩沖液中調(diào)高鹽（NaCl）濃度，可以提高RNA產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，我們使用該緩沖液裂解我們的樣品。大多數(shù)提取方法都使用此緩沖液來提取RNA，同時聯(lián)合使用苯酚/氯仿法從蛋白質(zhì)中分離出核酸。但是，我們不使用苯酚和氯仿，因為它們具有毒性，同時它們不可能在96孔板中實現(xiàn)高通量。因此，我們決定通過加入一定量的異丙醇，并在裂解步驟后離心樣品，來得到RNA沉淀（圖1）。在這個階段，蛋白質(zhì)和不需要的化合物（如多糖和多酚）會溶解在上清液中，并且很容易可以除去。用乙醇洗滌沉淀后，將核酸重懸，并進(jìn)行DNase處理，然后在異丙醇中進(jìn)行另一輪沉淀并洗脫以回收RNA。圖2中的質(zhì)量控制顯示RNA未被降解，并且260/280的比率高于1.79，表明提取過程中蛋白質(zhì)被去除。260/230的比例在1.2至1.56之間，具體取決于物種，這表明殘留了一些多糖。
為了改進(jìn)方法，在60°培養(yǎng)步驟后將1％SDS添加到裂解緩沖液中。SDS是一種清潔劑，可幫助消化細(xì)胞膜并在此步驟中釋放更多核酸。SDS還具有破壞核酸/蛋白質(zhì)相互作用，并促進(jìn)CTAB /核酸復(fù)合物溶解的特性，從而改善了核酸的沉淀并提高了產(chǎn)量。用SDS本身提取的樣品獲得的RNA產(chǎn)量比CTAB / PVP緩沖液更好。但是，260/230的比例非常低（1.07），無法防止樣品氧化（圖3a）。結(jié)合CTAB和SDS方法來改善產(chǎn)率（圖2、3）。這在夏威夷果中尤為明顯，其RNA產(chǎn)量幾乎翻了一番。如通過裂解步驟后的樣品顏色觀察（圖 3a），CTAB / PVP和SDS的組合也抑制了樣品氧化和葉綠素變性，這是SDS的已知作用。CTAB和SDS之間的相互作用形成微膠束，產(chǎn)生可見的混濁沉淀，導(dǎo)致離心后在緩沖液和空氣之間界面處形成半固體白色層。
因沒有CTAB或樣品管中有植物組織，SDS對產(chǎn)量的影響并未降低（圖3）。這表明在該方法中，SDS對產(chǎn)量的影響可能是由于其從核酸中分離蛋白質(zhì)的能力，而不是其組織裂解活性或其溶解CTAB /核酸復(fù)合物的性質(zhì)。此外，添加SDS還可略微提高牛油果和夏威夷果的260/230比例，這表明CTAB和SDS的組合可在最終洗脫過程中稍微降低多糖含量（圖3）。
2、從不同組織類型中提取RNA
然后，我們測試了該方法對于不同類型的組織是否有效。為了測試這一點，我們使用15–30 mg的四種不同夏威夷果組織（葉、莖、花、腋芽）進(jìn)行了相同的步驟。質(zhì)量/數(shù)量控制表明，該方法對夏威夷果的這四種組織類型均有效（圖4）。還對根組織進(jìn)行了測試，但結(jié)果不一致，不能認(rèn)為是成功的（數(shù)據(jù)不包括在內(nèi)）。從莖和休眠腋芽中提取的RNA量要少于從葉和花中提取的RNA，這可能是由于這種組織中所含的活細(xì)胞數(shù)量較少。對于所有組織，260/280均高于1.79，表明蛋白質(zhì)已從樣品中有效去除。260/230比值較低，這可能是由于這些組織類型中包含大量次要化合物。
3、使用96深孔板提取RNA
我們希望能開發(fā)一種可以同時提取大批量樣本的方法。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，我們注意到該方法的一個特點：在裂解步驟之后，該方法不需要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行移液，不像使用苯酚和氯仿的方法一樣。因此，我們在2 ml 96深孔板上使用與樣品管進(jìn)行相同的步驟。與樣品管結(jié)果相比，使用深孔板提取的結(jié)果令人滿意，可以在圖5中所示的質(zhì)量控制結(jié)果看出。且使用96深孔板方法，僅需一天即可提取96個樣品（不包括研磨時間），而使用96通道的移液器（PLATEMASTER，Gilson）可以使花費(fèi)的時間更短。
4、實時定量PCR和RNA-Seq讀取質(zhì)量控制
為了證明提取方法所產(chǎn)生的RNA質(zhì)量足夠好，我們使用RNA進(jìn)行實時定量PCR和RNA測序。用DORMANCY1（DRM1）和miR172在三種樹種中獲得的擴(kuò)增（圖 6）和解鏈曲線（附加文件1：圖S1）證明，RNA可成功用于定量RT-PCR（圖 6）。這些結(jié)果表明，即使在某些樣品中260/230比值不是最佳的，用這種方法分離的RNA的質(zhì)量也足以進(jìn)行基因和miRNA定量分析。
為了進(jìn)一步證明我們的RNA提取方法的適用性，我們使用該方法為牛油果、夏威夷果和芒果樹中的每一種樣品制備標(biāo)準(zhǔn)化的RNA-Seq庫，并使用Illumina測序技術(shù)對其進(jìn)行了測序。使用此方法獲得的基因庫質(zhì)量控制數(shù)據(jù)表明，使用本文所述方法提取的RNA質(zhì)量很好，完全滿足RNA提取實驗要求（圖 7和附加文件2：圖S2）。在使用Trimmomatic進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)修整和質(zhì)量控制后，使用FastQC版本0.11.5（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）進(jìn)行質(zhì)量評估，數(shù)據(jù)表明質(zhì)量良好（圖7），且具有統(tǒng)一的高質(zhì)量堿基調(diào)用，以讀取正向（圖 7）和反向（附加文件2：圖S2）序列的末尾。這說明大多數(shù)序列讀數(shù)均為高質(zhì)量，這為后續(xù)的遺傳分析提供了保障。
5、序列映射檢測
為了驗證我們的RNA測序，我們使用HISAT v.2（默認(rèn)設(shè)置）將修飾后的序列映射到已發(fā)布的轉(zhuǎn)錄組和基因組序列中（如表1）。我們牛油果樣品中有76％和80％的讀段映射到Persea americana var'drymifolia' and cv. ‘ Lisa’轉(zhuǎn)錄組序列集中。我們芒果樣品的讀段中有66％和69％映射到印度芒果（Mangifera indica L. cv. 'Shelly' and 'Zill'轉(zhuǎn)錄組序列集中。我們夏威夷果樣品中有79％的讀斷映射到夏威夷果Madamadia integrifolia cv. 741 ‘Mauka’基因組序列集草案中。這種質(zhì)量控制進(jìn)一步支持了用我們的方法提取的RNA的質(zhì)量足以進(jìn)行各種轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。
6、無苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based DNA提取
對樹木進(jìn)行DNA提取方法時通常遇到的問題與RNA提取方法相同。因此，我們決定測試這種RNA提取方法是否可以轉(zhuǎn)換為基因組DNA提取方法。為實現(xiàn)此目的，我們通過用RNase代替CTAB緩沖液中的DTT來修改方法，以在裂解步驟中去除RNA。對于RNA提取，在裂解步驟結(jié)束時添加1％的SDS，并執(zhí)行一次沉淀/洗滌/洗脫循環(huán)以回收純化的DNA（圖8）。我們的樣品還包括來自室外種植的咖啡樹和桉樹的成熟葉片樣品，這兩個物種在DNA提取方面眾所周知是有挑戰(zhàn)性的。圖9所示的是質(zhì)量和數(shù)量控制結(jié)果，圖示表明，所獲得的提取量令人滿意，并且提取的DNA沒有降解。因此證明，該方法可以轉(zhuǎn)化為困難的熱帶和亞熱帶物種樣品的DNA提取方法。
四、結(jié)論
在過去的十年中，轉(zhuǎn)錄組測序的價格已大大降低，促使研究人員設(shè)計更大規(guī)模的實驗。但是，用于木質(zhì)熱帶物種的核酸提取的化學(xué)藥品的毒性和不實用性，是這些樣品進(jìn)行大規(guī)模實驗主要面臨的問題。我們在此描述的方法可以降低這些問題的影響，并將促使人們進(jìn)行更多大規(guī)模的實驗，以便于研究在分子生物學(xué)中被認(rèn)為是困難的物種。
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com