單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）的十個(gè)問答解惑
Q1：為什么要進(jìn)行單細(xì)胞測序？
A1：單細(xì)胞，就是從單個(gè)細(xì)胞出發(fā)去做研究。細(xì)胞是組成生命體的最基本單元，從基本單元出發(fā)去研究，才能從小到大，以點(diǎn)到面，從局部到整體去理解生物學(xué)問題。曾經(jīng)有朋友給我看了下面的圖片，形象地展示了從Bulk研究到單細(xì)胞研究的必要性。
Q2：單細(xì)胞測序能做哪些層面的檢測？
A2：單細(xì)胞研究現(xiàn)在最多的是轉(zhuǎn)錄組研究，稱為scRNA-seq的方法進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。當(dāng)然，雖然已發(fā)表的研究很多，但可實(shí)現(xiàn)的檢測還有染色質(zhì)可接近性檢測（chromatin accessibility，ATAC-seq）,CNV檢測，免疫組庫測序，表面蛋白檢測。
Integrative single-cell analysis.Nat Rev Genet. 2019 Jan 29.
Q3：高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的樣本有什么要求？
A3：要想成功做成單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，第一個(gè)要求是細(xì)胞要是活的，現(xiàn)有商用平臺(tái)對(duì)細(xì)胞活率要求較高，最好能達(dá)到90%，原代細(xì)胞不能低于70%。另外，高通量檢測需要原始提供的細(xì)胞數(shù)量足夠，如果一次實(shí)驗(yàn)最終檢測到成千上萬個(gè)細(xì)胞，需提供高質(zhì)量細(xì)胞量達(dá)到10的5次方以上。同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)大小也有要求，一般細(xì)胞直徑在幾十微米以內(nèi)，最好40以下。植物細(xì)胞需要去除細(xì)胞壁，制備原生質(zhì)體。
Q4: 不滿足上述細(xì)胞樣本要求，還能做scRNA-seq嗎？
A4: 可以。由于實(shí)驗(yàn)樣本特殊性，不是所有的細(xì)胞都能滿足現(xiàn)有測序要求，比如神經(jīng)細(xì)胞等。這種情況下，進(jìn)行細(xì)胞核提取，進(jìn)行核轉(zhuǎn)錄組檢測是備選方案。當(dāng)然，細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄組檢測不能反應(yīng)所有的細(xì)胞信息，但是現(xiàn)有的研究已證明核RNA也能反應(yīng)細(xì)胞特征。
Science. 2019 May 17;364(6441):685-689.
Q5: 怎么定義數(shù)據(jù)分析得到的細(xì)胞類群？
A5: 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后會(huì)對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行區(qū)分，并且能得到每個(gè)類型的marker基因。但是，這個(gè)結(jié)果是不能將類群定義為現(xiàn)有認(rèn)知的已知類型。因此，需要對(duì)已知類群marker基因和數(shù)據(jù)分類得到的markers進(jìn)行匹配。如果匹配到某個(gè)類群里有已知的marker，就能對(duì)這些類群進(jìn)行已知類型標(biāo)記。
Q6: 不知道研究的組織有哪些marker，怎么辦？
A6: 雖然研究者對(duì)自身研究領(lǐng)域的marker有所了解是天經(jīng)地義的事情，但是對(duì)于剛?cè)腴T的小師弟小師妹來說可能難度有點(diǎn)大。幸運(yùn)的是，現(xiàn)有的一些數(shù)據(jù)庫可以給我們提供信息：
1.CellMarker(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/)，提供人的158個(gè)組織器官和小鼠81個(gè)器官的marker信息。數(shù)據(jù)信息收集來自100,000篇文獻(xiàn)報(bào)道。絕對(duì)是Marker界的數(shù)據(jù)庫Number 1；
2.CancerSEA(http://biocc.hrbmu.edu.cn/Can-cerSEA/)，收錄25種腫瘤類型的4萬多個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)。研究腫瘤的，不得不看的數(shù)據(jù)庫。
Q7: 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以做哪些后期數(shù)據(jù)挖掘？
A7: 除了細(xì)胞定義之外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)后續(xù)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，擬時(shí)序分析，細(xì)胞-細(xì)胞互作預(yù)測，細(xì)胞功能富集等數(shù)據(jù)挖掘。目的只有一個(gè)，通過每一個(gè)細(xì)胞中的基因表達(dá)，去推測細(xì)胞特定的生物學(xué)功能。
Q8: 擬時(shí)序分析可解決什么問題？
A8: 擬時(shí)間序列分析（Pseudotime分析）的字面意思是通過構(gòu)建細(xì)胞間的變化軌跡來重塑細(xì)胞隨著時(shí)間的變化過程。推斷單細(xì)胞軌跡是一個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)問題。第一步是選擇機(jī)器學(xué)習(xí)方法輸入的基因。這叫做特征選擇，它對(duì)軌跡的形狀有很大的影響。算法通過檢查這些基因在細(xì)胞群中的表達(dá)模式來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序。尋找以“有趣”(即不只是嘈雜)方式變化的基因，并利用這些基因來構(gòu)造數(shù)據(jù)。這些基因?qū)a(chǎn)生一個(gè)健壯、準(zhǔn)確和具有生物學(xué)意義的軌跡。因此，擬時(shí)序分析后的數(shù)據(jù)可以反應(yīng)細(xì)胞的變化過程，對(duì)于細(xì)胞發(fā)育過程，腫瘤演化等的理解非常有用。
Nat Methods. 2016 Oct;13(10):845-8.
Q9: 現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序有哪些可選平臺(tái)？
A9: 現(xiàn)有市場上運(yùn)用最廣，認(rèn)可度最高的是10X Genomics的Chromium System，BD公司的Rhapsody Single-Cell Analysis System也是不錯(cuò)的平臺(tái)。這兩個(gè)系統(tǒng)分別使用微滴微流控系統(tǒng)和微孔微流控系統(tǒng)。
Q10: 多個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，貴嗎？
A10: 這個(gè)問題相信是大家最關(guān)心的。怎么說呢，scRNA-seq說貴也貴，說不貴也不貴。單個(gè)樣本，現(xiàn)在的市場價(jià)在5位數(shù)的級(jí)別，但是平均到每個(gè)細(xì)胞，大概在10塊錢。所以，從某種意義上來說，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，還是性價(jià)比很高的。只選對(duì)的，不選貴的，當(dāng)一切以解決科學(xué)問題為目的，錢只是實(shí)現(xiàn)目的的工具而已。
