植物組織培養(yǎng)過程中，褐變問題普遍存在,與菌類污染和玻璃話現(xiàn)象并稱為植物組織培養(yǎng)的三大難題。針對褐變難題，本文結(jié)合相關(guān)資料，對影響褐變的因素作了全面分析，褐變的影響因素是復(fù)雜的，隨植物種類外植體的部位幾生理狀況培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的不同而危害的程度有所不同，對這些因素是內(nèi)因外界影響作用作了分析并針對這些因素提出了相應(yīng)的解決措施。
　　
在許多植物組織培養(yǎng)過程中，常遇到褐變問題。褐變主要發(fā)生在外植體，在植物愈傷組織的繼代、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)以及原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)中也經(jīng)常發(fā)生。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細(xì)胞、培養(yǎng)基等變褐，而且對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡。本文探討植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的影響因素、機理及防范措施，對我們進行科學(xué)研究或工廠生產(chǎn)，包括植物組織的培養(yǎng),原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞和植物器官的培養(yǎng)都有著十分重要的現(xiàn)實意義。
　　
一、褐變原因及危害
  
褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中,自身組織從表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物數(shù)量多少及多酚氧化酶活性有直接關(guān)系。很多植物，尤其是木本植物都含有較高的酚類化合物，這些酚類化合物在完整的組織和細(xì)胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在切割外植體時，切口附近的細(xì)胞受到傷害，其分割狀態(tài)被打破，酚類化合物外溢。對于外植體本身來講，酚類物質(zhì)從外植體切口向外溢出是一種自我保護性反應(yīng)，可誘導(dǎo)植保素或無物理屏障的形成，以防止微生物侵染組織。但酚類很不穩(wěn)定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水，醌類物質(zhì)又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活。從而導(dǎo)致組織代謝活動紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。此外，由于組織的老化病變也會使多酚氧化酶激活而引起褐變。
　　
二、褐變產(chǎn)生的機理
　　
⒈非酶促褐變
　　
非酶促褐變是由于細(xì)胞受脅迫或其他不利條件影響所造成的細(xì)胞程序化死亡或自然發(fā)生的細(xì)胞死亡，即壞死形成的褐變現(xiàn)象，并不涉及酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。將生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含NaCl的培養(yǎng)基中，組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒有看到擴散的褐化物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象。但這種褐變?nèi)舨扇∵m當(dāng)措施或者愈傷組織適應(yīng)了脅迫環(huán)境就不再發(fā)生了。
　　
⒉酶促褐變
　　
目前認(rèn)為植物組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶促褐變引起的，培養(yǎng)材料變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起的。酶促褐變?nèi)缤�一般的酶促反�?yīng)，其發(fā)生必須具備三個條件，即酶、底物和氧。引起褐變的酶有多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。從初次培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中試管苗的褐變程度和PPO的活性來看，表明PPO活性的高低是引起培養(yǎng)材料褐變的關(guān)鍵。引起褐變的酶的底物主要是酚類化合物，按其組成可分成3類:苯基羧酸（包括鄰羥基苯酚、兒茶酚、沒食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括綠原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、單寧、木質(zhì)素等），第三類是黃烷衍生物（包括花青素、黃酮、蕓香苷等），但并非所有的酚類物質(zhì)都是PPO的底物。
　　
在正常發(fā)育的植物組織中,底物、氧氣、PPO同時存在并不發(fā)生褐變，是因為在正常的組織細(xì)胞內(nèi)由于多酚類物質(zhì)分布在細(xì)胞的液泡內(nèi)，而PPO則分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)中，這種區(qū)域性分布使底物與PPO不能接觸。而當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和破壞時，則為酶創(chuàng)造了與PPO接觸的條件，在氧存在的情況下使酚類物質(zhì)氧化成醌，進行一系列的脫水、聚合反應(yīng)，最后形成黑褐色物質(zhì)，從而引起褐變。
　　
⒊褐變產(chǎn)生的影響因素
　　
影響植物組織培養(yǎng)褐變的因子是復(fù)雜的，因植物的種類、基因型、外植體部位及生理狀態(tài)等不同，褐變的程度也有所不同。
　　
⑴植物種類及基因型  不同的植物和不同的基因型決定了不同的褐化程度。在組織培養(yǎng)中，品種褐化難易可能是與該品種中多酚類物質(zhì)含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差異有關(guān)。
　　
⑵外植體部位及生理狀態(tài)  外植體的部位及生理狀態(tài)不同其褐化程度不同，同時，不同時期和不同年齡的外植體在培養(yǎng)中褐變的程度也不同。
　　
⑶培養(yǎng)基成分  培養(yǎng)基成分中的無機鹽、蔗糖濃度、激素水平等對褐變的程度的影響尤為重要。另外，其pH值也與褐變程度有較大關(guān)系。
　　
⑷培養(yǎng)條件  溫度過高或光照過強，均可加速被培養(yǎng)組織的褐變。不利環(huán)境條件都能造成細(xì)胞的程序化死亡，溫度是誘導(dǎo)程序化死亡的主要因素。
　　
⒋防止外植體產(chǎn)生褐變的對策
   
從理論上講,酶促褐變可以通過以下三種方法加以抑制:一是除去引起氧化的物質(zhì)——氧；二是捕捉或減少聚合反應(yīng)的中間產(chǎn)物；三是抑制有關(guān)的酶。實際操作上，下列措施是被認(rèn)為行之有效的。
　　
⑴適當(dāng)外植體的選擇
　　
取材時應(yīng)注意選擇褐變程度較小的品種和部位作外植體。成年植株比幼苗褐變程度厲害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴(yán)重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。王異星用荔枝無菌苗不同組織的誘導(dǎo)試驗表明，莖最容易誘導(dǎo)出愈傷組織，培養(yǎng)2周后長出淺黃色的愈傷組織；葉大部分不能產(chǎn)生愈傷組織或誘導(dǎo)出的愈傷組織中度褐變；而根極大部分不產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)出的愈傷組織全部褐變。
　　
⑵對外植體的處理 
　　
通過對較易褐變的外植體材料的預(yù)處理能減輕醌類物質(zhì)的毒害作用。處理方法如下：外植體經(jīng)流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70%酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織中的酚類物質(zhì)部分滲入培養(yǎng)基中。取出外植體用0.1%漂白粉溶液浸泡10分鐘，再接種到合適的培養(yǎng)基中。若仍有酚類物質(zhì)滲出，3-5天后再轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基2-3次，當(dāng)外植體的切口愈合后，酚類物質(zhì)減少，這樣可使外植體褐變減輕或完全被抑制。用抗壞血酸預(yù)處理香蕉吸芽外植體，能減輕外植體褐變，從而提高芽叢誘導(dǎo)率。
 
⑶適宜的培養(yǎng)基  
　　
培養(yǎng)基的成分與褐變程度有關(guān)，要考慮所選培養(yǎng)基的狀態(tài)和類型。  
　　
①適當(dāng)?shù)臒o機鹽濃度  在柿樹組織培養(yǎng)防止褐變所進行的試驗中，4種培養(yǎng)基的無機鹽以改良MS(大量元素減半) 和1/2MS的效果最好，MS的效果較差，結(jié)果證明低濃度的無機鹽可促進外植體的生長與分化，減輕外植體褐變的程度。徐振彪在對玉米幼胚耐NaCl愈傷組織的篩選表明，隨NaCl濃度升高，褐變現(xiàn)象加重。
　　
②適當(dāng)和適量的激素  王異星在荔枝的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加1 mg/L BA + 0.5mg/L 2,4-D時，愈傷組織較堅硬，增殖緩慢，易產(chǎn)生褐變。培養(yǎng)基中添加1mg/L BA+1mg/L 2,4-D 時，愈傷組織淺黃疏松，增殖也快。
　　
③培養(yǎng)基的硬度  在一定范圍內(nèi)，瓊脂用量大，培養(yǎng)基硬度大，褐變率低，這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴散速度的緣故。
　　
④培養(yǎng)基中水的硬度的影響  硬度低的蒸餾水褐變率低,而使用硬度較高的自來水,褐變嚴(yán)重,甚至?xí)�出現(xiàn)褐變死亡。這可能是配制培養(yǎng)基的水改變了培養(yǎng)基中無機鹽的濃度,間接地影響了植物外植體的褐變。
　　
⑤培養(yǎng)基的pH值  在水稻體細(xì)胞培養(yǎng)中，pH值為4.5-5.0 時MS液體培養(yǎng)基可保持愈傷組織處于良好的生長狀態(tài)，其表面呈黃白色，而pH值為5.5-6.0時，愈傷組織嚴(yán)重褐變。一般來說，酸性環(huán)境(pH值為4.5-5.0)不利于褐變過程的發(fā)生。
　　
⑥培養(yǎng)條件  如溫度過高或光照過強，光照會提高PPO的活性，促進多酚類物質(zhì)的氧化，從而加速被培養(yǎng)的組織褐變。高濃度CO2也會促進褐變，其原因是環(huán)境中的CO2向細(xì)胞內(nèi)擴散，細(xì)胞內(nèi)CO32-增多，CO32-與細(xì)胞膜上的CO32-結(jié)合，使有效CO32-減少，導(dǎo)致內(nèi)膜系統(tǒng)瓦解，酚類物質(zhì)與PPO相互接觸，產(chǎn)生褐變。因此，初期培養(yǎng)要在黑暗或弱光下進行。
　　
⑷添加褐變抑制劑和吸附劑
　　
褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO抑制劑。在培養(yǎng)基中加入偏二亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等抗氧化劑都可以與氧化產(chǎn)物醌發(fā)生作用，使其重新還原為酚。由于其作用過程均為消耗性的，在實際應(yīng)用中應(yīng)注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗壞血酸均對外植體無毒副作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可不受限制。在水稻細(xì)胞的培養(yǎng)基中，添加植酸(PA)，可防止褐變，PA分子中眾多的羥基產(chǎn)生抗氧化作用，使生色物質(zhì)的含量下降或PA與PPO分子中的Cu2 +結(jié)合，從而降低了其活力。陳學(xué)森等在對植酸在銀杏組織培養(yǎng)中應(yīng)用的研究中也證實了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
　　
常用的吸附劑有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)�；钚蕴渴且环N吸附性較強的無機吸附劑，能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等, 從而有利于培養(yǎng)物的生長。粉末狀的活性炭與顆粒狀的活性炭相比吸附性更強，一般在培養(yǎng)基中加入1-4g/L的活性炭。在使用過程中應(yīng)注意，盡量用最低濃度的活性炭來對抗褐變的產(chǎn)生，因為活性炭的吸附作用是沒有選擇性的，在吸附物質(zhì)的同時，也會吸附培養(yǎng)基中的其他成分，對外植體的誘導(dǎo)分化會產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一性吸附劑，在生化制備中常用作酚類物質(zhì)和細(xì)胞器的保護劑，可用于防止褐變。
　　
⑸進行細(xì)胞篩選和多次轉(zhuǎn)移
　　
在組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常進行細(xì)胞篩選，可以剔除易褐變的細(xì)胞。在外植體接種1-2天后應(yīng)立即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，能減輕酚類物質(zhì)對培養(yǎng)物的毒害作用，降低抑制作用，使外植體盡快分生，連續(xù)轉(zhuǎn)移5-6次，可基本解決外植體的褐變問題。