細胞鋪板是細胞實驗中最常見又必須掌握的一門技術(shù)，看似簡單，我們卻經(jīng)常遇到：如細胞居中或者中間稀疏等不均勻分布的現(xiàn)象，導致我們只能扔掉，重新鋪板。既耽擱時間又浪費了細胞及培養(yǎng)板等資源。歷經(jīng)多次失敗后，才發(fā)現(xiàn)原來細胞鋪板是有規(guī)律可循的，今天我們就聊一聊：細胞鋪板的技巧。

如下圖為：細胞鋪板時，常出現(xiàn)的細胞分布不均勻現(xiàn)象。

細胞居中和細胞邊緣化

首先，了解一下細胞鋪板的必要性！

從經(jīng)濟和高效的角度來說，需要根據(jù)實驗目的選擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板。如在進行藥物對待測細胞半抑制率（IC50）測試時，通常使用96孔板，一方面可以設置濃度梯度；另外還可一次性測多個藥物，減少實驗誤差。

如下表格：

常見的幾種培養(yǎng)板規(guī)格及其應用

細胞鋪板主要分為3大步驟：收集細胞→細胞計數(shù)→細胞鋪板

一、收集細胞   

即把培養(yǎng)皿/瓶的細胞消化收集，與傳代一樣，不再贅述。

二、細胞計數(shù)

一般傳代的細胞密度較大，在鋪板時最好控制細胞數(shù)量。一般采用血球計數(shù)板計數(shù)，對于體積較大的細胞如腫瘤細胞采用下圖藍色部分的白細胞計數(shù)區(qū)域，即利用四個角的四個大方格。

血球計數(shù)板模式圖（圖片來自百度）

計算原理：由于每個大方格子（紅框），邊長為1mm，蓋上蓋玻片后的高度為0.1mm，因此計數(shù)室內(nèi)加滿細胞懸液的體積為0.1mm³=10^-4cm³=10^-4ml。

細胞數(shù)量 = 4個大格子的平均數(shù)*稀釋倍數(shù)*10⁴個/mL

常見問題解答：

Q：細胞計數(shù)前后出現(xiàn)較大誤差？

• 考慮細胞沉降導致懸液不勻；懸液體積過大或過小；稀釋倍數(shù)太高或太低等原因造成。

Q：如何克服細胞懸液不均勻的問題？

• 盡量將細胞吹打為單個，防止抱團，且用移液槍充分吹打，使其均勻懸浮在培養(yǎng)基中。

Q： 一般加多少細胞懸液合適？

• 由于加入計數(shù)室的量，過少會導致計數(shù)室內(nèi)出現(xiàn)氣泡，過多則會使得計數(shù)板上的蓋玻片不緊貼計數(shù)板，使得高度變高，體積變大；計數(shù)室體積為9mm³，所以一般加15ul左右。

Q： 計數(shù)時，細胞稀釋倍數(shù)如何控制？

• 若是計數(shù)室細胞過稀或過密，會造成較大誤差，一般最適濃度為5～10×10⁵細胞/ml。如一般10cm皿的細胞約300-500萬個，一些細胞個體小也能達到1000-2000萬，可根據(jù)所需細胞數(shù)目取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。舉例來說可將100ul細胞懸液加入到900ul培養(yǎng)基中，混勻后進行計數(shù)，計數(shù)所得乘以10即為實際細胞密度。

Q： 計數(shù)的原則有哪些？

• 計數(shù)時對壓在最外圈邊線的細胞遵循“計上不計下，計左不計右”的統(tǒng)計學原則，遇到兩個以上的細胞組成的細胞團計為一個細胞。

三、細胞接種

根據(jù)操作手法，一般分為2類：

第一類：6孔板、12孔板和24孔板

各種培養(yǎng)板規(guī)格（來自Thermo Fisher）

操作步驟：

① 稀釋細胞：根據(jù)上述計數(shù)結(jié)果后，將細胞稀釋到目的濃度；

② 加入細胞懸液：充分混勻后，貼壁加入細胞懸液；

③ 搖勻：這一步很重要！接種結(jié)束后，將板在超凈臺上十字形搖勻，最后于顯微鏡下觀察。

注意事項：

• 鋪板后，不可以轉(zhuǎn)圈搖，因為細胞會被帶到中間；

• 如果培養(yǎng)液量少，由于瓶體內(nèi)液體有向邊緣吸的特性，所以造成中間低洼，細胞容易聚集�？梢远嗉狱c液體緩解，若6孔板一般加2ml，我們可以加到2.5ml。

第二類：96孔板/384孔板

96孔板/384孔鋪板時步驟與上述基本一致，只是多使用排槍，即不用搖勻。

96孔板/384孔板（來自Thermo Fisher）

注意事項：

• 用排槍吸取時，一定要保證每個槍頭吸上來的懸液體積一致；

• 鋪96孔板時，如果是用于進行MTS等長時間測試時，最外圈應空余出來，不接細胞，加入一圈PBS或多于細胞懸液，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應；

• 96孔板或384孔板鋪好細胞后最好不再搖晃，小心地放入培養(yǎng)箱即可。

常見問題解答：

Q： 如何避免每個孔之間的細胞不均勻？

• 鋪板速度盡量快點，在加完半邊板后，需要再次將培養(yǎng)皿內(nèi)剩余的細胞懸液充分混勻再繼續(xù)鋪板。

Q：十字形搖勻具體是怎么搖？

• 放在水平板面上先上下移動，再左右移動，每個方向5到6次。

Q：對于某些容易聚團的細胞，該怎么辦？

• 對于容易聚團的細胞，盡管當時搖勻了，但是靜置30min后，取出后將細胞培養(yǎng)板后，肉眼即可見嚴重的細胞居中抱團現(xiàn)象，比如乳腺癌細胞MDA-MB-231。對于這種細胞解決辦法：從個人經(jīng)驗來看，若是時間允許的話，可以降低接種密度，可以隔一天細胞多了再進行藥物處理或者劃線等。

Q：為啥要貼側(cè)壁加入細胞懸浮液？

• 一般從孔的左邊靠近底部貼壁加入，不要從中間加入；因為接種之前已將細胞懸液做過充分混勻，直接從側(cè)壁加入能盡量保持細胞懸液的均勻狀態(tài)；另外貼側(cè)壁加入也能減少孔內(nèi)氣泡的產(chǎn)生。

Q：如何把握細胞密度？

• 細胞密度對于鋪板很重要，過密很容易造成細胞居中，過稀會造成細胞難以生長起來。一般進行預實驗，我們通常會設計一組不同細胞密度對報告基因度值影響的預實驗，從而根據(jù)實驗結(jié)果來確定細胞的具體接種數(shù)量。

Q： 有些貼壁不牢的細胞在細胞培養(yǎng)板中收取上清或移除上清時應注意什么？

• 有些細胞如293T細胞貼壁不牢，如果需要在96孔板中進行實驗時，如果需要吸除上清，應避免直接使用吸泵等吸力過大的設備，另外可以在收板時使用培養(yǎng)板專用離心機離心后在取出上清。另外也可以在接板前使用千分之一的明膠提前加入培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱孵育30分鐘以上后再將細胞接入。

細胞鋪板是個熟能生巧的實驗，本期我們是根據(jù)多年實戰(zhàn)經(jīng)驗介紹的技巧，供大家參考，但鑒于每個人手法不同，培養(yǎng)的細胞特性也因人而異，因此，還需要實踐中多多練習，了解你手中細胞的特性，進而擁有一套屬于你的操作手法。如果你的實驗中有更好的方法，也歡迎大家積極討論，互相學習！