學(xué)會正確地進行細胞培養(yǎng)是細胞實驗的基礎(chǔ)，然而小心翼翼的你，怎奈何體外細胞的脆弱，百密終有一疏。你偶然的一個噴嚏，不經(jīng)意得捋捋你的頭發(fā)絲，對于這些丟失體外抵抗能力的細胞都可能是毀滅性的災(zāi)害。但是，并非所有的細胞污染都是致命的，若是及時發(fā)現(xiàn)，還是可以得到挽救的。今天咱們的主題就是：教大家辨別各種細胞污染及如何應(yīng)對。

如下圖：實驗室常見的細胞污染，你都知道屬于哪種污染嗎？

細胞培養(yǎng)中的常見污染主要包括：細菌、霉菌、支原體、黑膠蟲、病毒和交叉污染等，每一種污染都有各自的特點。如細菌和霉菌增殖迅速，短時間就對細胞造成明顯傷害；而支原體和病毒對細胞的影響則是一種緩慢長期的過程。下面就具體看看每一種污染。

1. 細菌污染（較容易被發(fā)現(xiàn)）

引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等；

細菌污染種類：白色葡萄球菌，大腸桿菌，假單孢菌、枯草桿菌等；

細胞污染后的變化：

①污染后由于有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，因此培養(yǎng)基會短時間內(nèi)由紅色變?yōu)辄S色；

②由于細菌大量增殖，培養(yǎng)基變渾濁，稍微振蕩后可見培養(yǎng)基表面有漂浮物；

③普通倒置顯微鏡高倍鏡觀察，胞漿內(nèi)可見大量顆粒（如下圖紅色箭頭）；

④細胞生長緩慢，逐漸變圓脫落。

如下圖所示：左：懸浮細胞污染后，可見懸浮細胞個體遠大于桿狀細菌，而細菌呈黑色顆粒狀并會有較快的運動速度；右：貼壁細胞，可看到球狀細菌分布于細胞周圍并做劇烈運動。

細菌污染的細胞（左懸浮細胞，右貼壁細胞）

圖片來源：UNC School of Medicine

處理措施：

• 在培養(yǎng)液中添加雙抗（P/S）處理；可用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48h后再換常規(guī)培養(yǎng)液；

• 另外添加西司他丁鈉和亞胺培南（泰能）處理細胞，適用于培養(yǎng)用具被打翻、使用了污染的培養(yǎng)液或要培養(yǎng)污染的組織或者凍存細胞的污染情況[1]。

• 裸鼠體內(nèi)接種法是比較有效和徹底的除菌方法。主要包括腹水接種和皮下荷瘤分離細胞。既能徹底清除污染細菌，又能保持腫瘤細胞的來源特征和惡性特性。對于一些特別珍貴的腫瘤細胞，可采用裸鼠體內(nèi)接種法[2]。

2. 霉菌污染（較容易被發(fā)現(xiàn)）

引起原因：操作不規(guī)范或無菌措施不到位等；

污染種類：白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，曲霉菌，孢子菌等；

細胞污染后的變化：

①一般來說，培養(yǎng)液不會變渾濁；

②比較容易發(fā)現(xiàn)，肉眼可見點狀菌落（淡黃色或者白色）漂浮在培養(yǎng)基表面（如下圖左）；

③普通倒置顯微鏡下觀察，可見絮狀交錯的菌絲或菌團生長在細胞之間；有時真菌并不是直接分布于細胞貼壁層，需要通過調(diào)整顯微鏡仔細觀察尋找菌絲或菌團（如下圖右）。

如下圖所示：懸浮細胞U397的霉菌污染，黃色圓形發(fā)亮的是U397；紅色箭頭：霉菌的菌絲和孢子囊，特別的是孢子釋放出來后是難以被酒精殺死。

霉菌污染后的懸浮細胞（圖片來源InCelligence網(wǎng)站）

處理措施：

• 添加制霉菌素和兩性霉素B，但是對細胞的毒性也較大；

• 環(huán)境徹底消毒：先后用酒精、新潔爾擦洗培養(yǎng)箱；水盤加上飽和量的硫酸銅。

• 若細胞不是特別珍貴，建議丟棄。

3. 支原體污染（難被發(fā)現(xiàn)）

支原體是一種自然界中能獨立生活的最小微生物，能通過細菌濾器，在細胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率很高[3]。由于支原體可以與細胞共存，生長速率受影響較小，而被忽視。支原體污染在細胞培養(yǎng)污染中最為隱蔽和最難察覺，但是支原體能明顯影響宿主細胞代謝、RNA合成及基因表達的作用，因此越來越受到重視。

引起原因：主要來源于是已感染支原體細胞之間的交叉污染，支原體感染的血清和胰酶等；

細胞污染后的變化：

①培養(yǎng)液不變渾濁，但會很快變成黃色；

②多數(shù)細胞在形態(tài)方面少有明顯變化；

③在倒置顯微鏡下可見胞漿出現(xiàn)小顆�；蚩张�；

如下圖：支原體個體很小，需要使用透射電鏡才能清晰看到其結(jié)構(gòu)及分布，圖中紅色箭頭即為支原體，其分布在細胞周圍。

支原體污染后的透射電鏡圖[4]

處理措施：

• 定期用支原體試劑盒檢測；

• 換液可以減緩污染情況，但無法根除；

• 支原體清除試劑盒可以達到較好效果；

• 小鼠腹腔巨噬細胞清除法。

4. 黑膠蟲污染

引起原因：往往來源于血清；

細胞污染后的變化：

①低倍鏡下觀察時可見黑色小點，高倍鏡下可見到其做布朗運動，像小蟲游來游去；

②細胞培養(yǎng)液仍然清亮，污染較輕時對細胞無影響；若太多就會對細胞造成影響。

如下圖：紅色箭頭所示黑膠蟲分布于細胞間。

黑膠蟲污染后的細胞[5]

處理措施：

• 更換血清；增加細胞密度，提高細胞的生長率。

5. 病毒污染

引起原因：病毒可能來自于血清；

細胞污染后的變化：

①污染后培養(yǎng)液無明顯變化；

②大部分細胞也不會有明顯的形態(tài)變化；

6. 交叉污染

引起原因：兩種或兩種細胞以上的實驗同時進行，實驗器具、試劑等混用而易造成的污染；

檢測手段：可通過鏡檢觀察細胞形態(tài)是否與所培養(yǎng)細胞形態(tài)一致來判斷，另外還可以通過各種免疫學(xué)試驗、同功酶分析及細胞遺傳學(xué)方法來確定。

處理方式：針對病毒和交叉污染較難清除，建議丟棄細胞重新培養(yǎng)；

看到這里，文章開頭的那幾張圖片代表著什么污染，你能辨別了嗎？可以在下方給我們留言，看看你是否掌握了這項技能哦！

學(xué)會對各種污染情況的辨別和處理是一項不可或缺的實驗技能，希望大家在看完我們的文章后結(jié)合你的實驗操作，學(xué)會如何應(yīng)對細胞污染。

參考文獻：

1.江千里, 王健民, 江汕,等. 西司他丁鈉+亞胺培南消除細胞培養(yǎng)中細菌污染的研究[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004, 25(1):114-115.

2.王鴻、張偉、孟娜. 細胞培養(yǎng)中珍貴貼壁細胞污染挽救方法的評價[J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2011,26 (1):1006-7795.

3.Olareringeorge A O, Hogenesch J B. Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(5): 2535-2542.

4.Shlomo R, Nechama S K, Jonathan D K,. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas.  DOI: 10.5772/51518

5.辛顏彬．細胞培養(yǎng)污染的發(fā)生、預(yù)防及清除［J］．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1989，13( 6):468-470．