為什么細(xì)胞養(yǎng)不好？你可能忽略了這些細(xì)節(jié)
細(xì)胞傳代培養(yǎng)（來自http:///cell-culture）
接下來我們就從細(xì)胞的衣食住行到傳宗接代為大家逐一介紹，細(xì)胞培養(yǎng)時中常遇到的那些不可忽視的問題，及我們該如何解決呢？
一、細(xì)胞的營養(yǎng)來源
針對大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，營養(yǎng)配方一般為：90%合成培養(yǎng)基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；為了防止污染，可以加1%雙抗！
常見問題解答：
Q：針對不同細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基配方一樣嗎？如何獲知呢？
A：不同細(xì)胞的培養(yǎng)基是不同的。一般ATCC購買的細(xì)胞，針對不同細(xì)胞株，會有詳細(xì)介紹，包括生長的狀態(tài)圖、培養(yǎng)基的類型等。如人源乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞一般為1640，人源肺癌細(xì)胞A549可用DMEM培養(yǎng)基。
Q：培養(yǎng)基為什么一般都是偏紅色？
A：因?yàn)榕囵B(yǎng)基加了酚紅來顯示顏色，指示pH范圍為6-8，顏色會由黃變?yōu)樽霞t。這是為了我們能更直觀觀察培養(yǎng)液的變化，如變黃，則代表偏酸，偏堿性了就顯示偏紫色。一般來說，細(xì)胞吸收營養(yǎng)后，變黃后就暗示我們要換培養(yǎng)基啦！所以密切觀察很重要哦！
Q：大多數(shù)細(xì)胞系可以在不止一種培養(yǎng)基中生長，那可以替換嗎？
A：不建議更換ATCC指定的培養(yǎng)基，因?yàn)楫?dāng)培養(yǎng)基改變時，細(xì)胞的性質(zhì)可能也會變化。
Q：若是細(xì)胞生長緩慢，是否可以增加血清比例？
A：可以！
二、細(xì)胞的居住環(huán)境
舒適無菌的環(huán)境是細(xì)胞健康生活的重要基礎(chǔ)。如下圖為培養(yǎng)細(xì)胞的器皿，包括形狀、規(guī)格、用途多樣的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板。最終住進(jìn)37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱。
Corning細(xì)胞培養(yǎng)皿/板/瓶規(guī)格
常見問題解答：
Q：細(xì)胞培養(yǎng)板規(guī)格不一，如何正確選用？
A：根據(jù)不同規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)皿/板容量及用途，如流式一般用 6 孔，爬片一般用 24 孔，MTT 一般用 96 孔，等。具體信息如下圖所示。
（注：不同細(xì)胞大小形態(tài)不同，所獲細(xì)胞量不同，上表中所獲細(xì)胞量根據(jù)1*105個/cm2的密度計(jì)算而得。）
Q：細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶區(qū)別？
A：就細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)來說，培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)皿沒有太大區(qū)別，主要在于安全系數(shù)（培養(yǎng)瓶＞培養(yǎng)皿）、培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量（大培養(yǎng)瓶＞培養(yǎng)皿）。但是培養(yǎng)瓶成本也會相對較高，因此無特殊要求，一般選擇培養(yǎng)皿即可。
三、細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存（原則是慢凍速融）
1. 細(xì)胞復(fù)蘇：指將凍存的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長的過程。
復(fù)蘇過程如下圖所示：（操作步驟不再贅述）
常見問題解答：
Q：為什么細(xì)胞復(fù)蘇后，很多難以貼壁？
A：忽略培養(yǎng)基的問題，主要考慮細(xì)胞凍存時狀態(tài)差或者復(fù)蘇時動作太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。切記最重要的融化速度要快，可不時搖動冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5～0℃）。
Q：為什么細(xì)胞貼壁了，卻長不起來？
A：此時需要考慮的是細(xì)胞密度問題，一些細(xì)胞傾向于維持一定的密度，若復(fù)蘇的細(xì)胞生長緩慢，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到較小的培養(yǎng)瓶/皿中培養(yǎng)。
2. 細(xì)胞凍存 將細(xì)胞放在低溫環(huán)境（-70℃~-196℃），細(xì)胞內(nèi)的代謝降低，可最大限度的保存細(xì)胞活力，以便長期儲存。
常見問題解答：
Q：目前細(xì)胞凍存液多采用的什么配方？
A：目前細(xì)胞凍存多采用DMSO二甲基亞砜或甘油作保護(hù)劑，細(xì)胞凍存液的配方有很多種，如培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，復(fù)蘇存活率在80%～90%以上。
Q：若沒有細(xì)胞凍存盒，我們該怎么辦？
A：可先將凍存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或過夜，最后放入液氮罐內(nèi)。為了節(jié)約時間，還可直接在凍存盒外包裹一團(tuán)棉花，用棉花代替凍存盒緩慢降溫的特點(diǎn)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮保存。
Q：細(xì)胞凍存時對細(xì)胞量有要求嗎？
A：細(xì)胞復(fù)蘇時會有一定的細(xì)胞死亡，因此細(xì)胞的濃度應(yīng)足夠高，起始濃度106—107個/ml/管；
四、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
細(xì)胞傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不斷增殖，培養(yǎng)皿/瓶空間有限，當(dāng)細(xì)胞接觸過密，生長就會受到抑制，影響細(xì)胞狀態(tài)，因此我們要把其中一部分細(xì)胞分到別的培養(yǎng)皿/瓶里。
如下圖為操作的基本過程：
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)https://www.abmgood.com/marketing/knowledge_base/cell_culture_introduction.php）
以上是貼壁細(xì)胞的操作方法，懸浮細(xì)胞傳代很簡單，不需消化，只需收集和分裝。
如下圖為貼壁和懸浮細(xì)胞的形態(tài):
常見問題解答：
Q：為什么我們總說選擇對數(shù)期細(xì)胞傳代？
A：如下圖：細(xì)胞的生長和分裂，一般遵循以下模式：停滯期，對數(shù)期（指數(shù)期），平穩(wěn)期（平臺期）和衰退期。為了確�；盍�，遺傳穩(wěn)定性和表型穩(wěn)定，必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期。
細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長曲線
Q：那如何確定細(xì)胞對數(shù)期？
A：根據(jù)上述細(xì)胞生長曲線，為了確保活力，必須使細(xì)胞保持在對數(shù)期就傳代，所以一定不能等到細(xì)胞長滿100%融合時才去消化傳代。一般細(xì)胞長到 70% -80%左右即可傳代。
Q：一般細(xì)胞傳代都是1分2嗎？
A：要根據(jù)不同細(xì)胞而定，如有的生長很快，比如說4T1細(xì)胞，傳代取離心懸液的十分之一就已經(jīng)足夠了。有的又特別慢，比如 BT474。此時我們就要多觀察摸索最合適的傳代比例。
Q：消化很關(guān)鍵嗎？
A：不得不說，細(xì)胞狀態(tài)差，很多時候與傳代時胰酶消化密切相關(guān)。一般腫瘤細(xì)胞消化1-2min即可。但是每一種細(xì)胞貼壁能力不同，因此對胰酶的反應(yīng)也不同，我們需要密切跟蹤。一般肉眼觀察到貼壁細(xì)胞層能移動即可終止；而非細(xì)胞全部分散成單個。如下圖分別是正確和錯誤的消化時間：
Q：部分比較難消化的細(xì)胞怎么辦？
A：可放于37℃培養(yǎng)箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受細(xì)胞為例，放于37℃培養(yǎng)箱消化5-8min，輕輕拍打，才見細(xì)胞成片移動，因此針對難消化細(xì)胞一定要在顯微鏡下密切觀察。
Q：幾天換培養(yǎng)基？
A：正常情況下，培養(yǎng)液偏紅色。如果細(xì)胞維持在pH6.5～6.6條件下，培養(yǎng)基變黃，說明培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物已堆積到一定量，細(xì)胞會脫落死亡，需要更換新鮮培養(yǎng)液。一般細(xì)胞生長旺盛時1～2天換一次，生長緩慢時，3～4天亦可。針對復(fù)蘇后的細(xì)胞，建議隔天換液。
Q：每天觀察細(xì)胞有必要嗎？
A：一般的腫瘤細(xì)胞我們是隔天傳代，但是切不可忽略對細(xì)胞的觀察，一定要每天都要去看一下細(xì)胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。記住，是每天。
Q：如果細(xì)胞形態(tài)不清晰或有異物等，如何處理？
A：可以考慮如下操作：首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，用新的培養(yǎng)基或者PBS洗滌2-3次，再開始正式的消化、吹打。其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。后續(xù)再密切觀察。
Q：細(xì)胞污染怎么辦？
A：如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染，一般應(yīng)立即丟棄。如果細(xì)胞非常寶貴，可試著加入含抗生素的培養(yǎng)基反復(fù)清洗，并用抗生素含量高的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基；
本期的內(nèi)容就介紹到這里了，細(xì)胞培養(yǎng)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基石，看似簡單的傳代卻有著大學(xué)問，希望大家在實(shí)踐操作中，可以結(jié)合我們?yōu)榇蠹姨峁┑男〖?xì)節(jié)，多多聯(lián)系和摸索，相信你的細(xì)胞會養(yǎng)的更加漂亮！
參考文獻(xiàn)：ATCC的動物細(xì)胞培養(yǎng)指南 ATCC®ANIMAL CELL CULTURE GUIDE tips and techniques for continuous cell lines
