基因療法以其“一次給藥，終身受益”的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到醫(yī)療市場(chǎng)的青睞。截至目前，歐洲藥品管理局（EMA）、美國(guó)食品藥品管理局（FDA）及中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（NMPA）等機(jī)構(gòu)至少已批準(zhǔn)13種基因治療產(chǎn)品上市，同時(shí)還有2500多項(xiàng)細(xì)胞和基因治療正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。2019年8月，國(guó)際頂級(jí)期刊《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（簡(jiǎn)稱(chēng)NEJM）發(fā)表了題為《Gene Therapy》的最新綜述，從基本原理出發(fā)，介紹了目前為止基因治療的臨床應(yīng)用和上市藥物，并著重討論了基因治療現(xiàn)階段存在的問(wèn)題和挑戰(zhàn)[1]。本文基于這篇綜述，重點(diǎn)從病毒載體的角度來(lái)介紹一下當(dāng)前基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀。

01、傳統(tǒng)藥物面臨挑戰(zhàn)，基因藥物蓄勢(shì)待發(fā)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前還以化學(xué)療法，放射療法和外科手術(shù)為主。其中許多藥物都是化學(xué)合成藥劑，旨在改變身體的化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生依賴(lài)性，并且通過(guò)減少疾病的癥狀和延長(zhǎng)患者的壽命來(lái)實(shí)現(xiàn)暫時(shí)的緩解。然而，這些傳統(tǒng)藥劑面臨許多挑戰(zhàn)：包括溶解度和生物利用度低，體內(nèi)物理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，循環(huán)半衰期短，體內(nèi)滲透性低，組織分布性差以及高劑量易引起毒性。

以蛋白類(lèi)藥物為例，基于蛋白質(zhì)和肽類(lèi)的藥物已成為目前市面最常用的治療藥物，目前全世界有近380種市售藥物。然而，將治療性蛋白質(zhì)引入患者體內(nèi)的一個(gè)不利因素將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，炎癥和發(fā)熱癥狀。為了解決這一系列的問(wèn)題，高質(zhì)量治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝變得極為復(fù)雜，但是目前開(kāi)發(fā)治療性蛋白的工藝涉及5000多個(gè)關(guān)鍵步驟。因此，開(kāi)發(fā)化學(xué)和蛋白療法的不可預(yù)測(cè)性太高，時(shí)間和投入成本太大。

基因療法能實(shí)現(xiàn)治療性蛋白的長(zhǎng)期表達(dá)和組織特異性表達(dá)，無(wú)需藥物干預(yù)，放療或手術(shù)治療，即可從根源上解決傳統(tǒng)療法存在的一系列問(wèn)題。并且這一新興的治療方法可針對(duì)單基因遺傳病，心血管疾病，免疫缺陷性疾病和癌癥等多種疾病。

02、基因治療的基本原理及分類(lèi)

基因治療是指將功能基因遞送到患者體內(nèi)，以替換或糾正功能障礙，從而治愈疾病。鑒于基因遞送方式的不同，基因治療主要分為離體和在體基因療法兩大類(lèi)：（如下圖所示）

圖1. 基因治療的2種方式（體外-左；在體-右）[1]

1. Ex vivo

▲ 又稱(chēng)離體基因治療，從患者體內(nèi)分離細(xì)胞，將整合載體在體外導(dǎo)入這些細(xì)胞，進(jìn)行基因工程改造，隨后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。

▲ 治療疾病的代表：CAR-T細(xì)胞免疫療法[2]、地中海貧血和鐮狀細(xì)胞貧血。EMA獲批的由BlueBird Bio公司開(kāi)發(fā)的Zynteglo就是一種基于慢病毒載體的離體基因療法[3]。

2. In vivo

▲ 又稱(chēng)在體基因治療，是將非整合載體直接注射給患者，使得功能性矯正基因被遞送至患者體內(nèi)，恢復(fù)疾病正常表型。

▲ 治療疾病的代表：先天性黑朦癥[4]，脊髓性肌萎縮癥[5]和血友病[6, 7]等。

二者各自?xún)?yōu)勢(shì)和挑戰(zhàn)

離體基因治療：由于利用自體細(xì)胞，因而不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)；同時(shí)還可在體外篩選到高效轉(zhuǎn)導(dǎo)以及無(wú)脫靶的細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效安全的治療效果。但由于步驟繁瑣，細(xì)胞活力低等缺點(diǎn)也受到一定的局限。此外，整合型載體的使用更易引起體內(nèi)的隨機(jī)插入，進(jìn)而產(chǎn)生癌變也是亟需解決的問(wèn)題之一。

在體基因治療：由于其操作簡(jiǎn)便，對(duì)于一些體外無(wú)法培養(yǎng)的細(xì)胞類(lèi)型是最優(yōu)選擇。但由于體內(nèi)編輯的不確定性，無(wú)法避免很多隨機(jī)整合或脫靶等事件，并且一些病毒載體還會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)危及生命的免疫反應(yīng)。因此，開(kāi)發(fā)和優(yōu)化新型的基因遞送載體系統(tǒng)，使治療基因能更安全有效地遞送到靶向細(xì)胞或組織，將極大地促進(jìn)基因治療在臨床應(yīng)用中的進(jìn)程。

03、理想的載體是基因治療的關(guān)鍵

如上所述，不管是體內(nèi)還是體外基因治療，理想載體的選擇是基因治療成敗的關(guān)鍵，它們應(yīng)該具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：

▲ 有足夠的空間來(lái)遞送大片段的治療基因；

▲ 具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能感染分裂和非分裂的細(xì)胞；

▲ 能靶向特定的細(xì)胞，且可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因；

▲ 具有較低的免疫原性的或致病性，不會(huì)引起炎癥；

▲ 具備大規(guī)模生產(chǎn)的能力。

因此，尋找合適的載體一直是基因治療的重要研究領(lǐng)域。目前針對(duì)基因治療的載體一般分為病毒和非病毒載體。下圖展示了臨床試驗(yàn)中各種遞送載體的占比情況，病毒載體是基因療法最常用的遞送系統(tǒng)（主要包括ADV、RV、AAV等），它也是世界上第一個(gè)用于基因治療的臨床研究載體。

圖2. 不同載體的臨床試驗(yàn)占比

1. 非病毒載體：主要通過(guò)物理和化學(xué)方法來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療性遺傳物質(zhì)，包括針，基因槍?zhuān)�電穿孔，聲孔效�?yīng)，光致成像，磁場(chǎng)轉(zhuǎn)換，加氫，機(jī)械按摩，脂質(zhì)體，磷酸鈣，二氧化硅和金納米粒子等。然而，由于它們操作復(fù)雜且存在固有的缺陷，其在基因治療的效果無(wú)法滿足臨床的需求。

2. 病毒載體：相較于非病毒載體，病毒載體更符合理想載體的要求，因此，大量研究人員正集中開(kāi)發(fā)新型的病毒載體，以求基因治療能夠安全有效地治愈人類(lèi)疾病。

截至目前已被用于基因治療的病毒載體主要有以下幾種：

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（RV）

▲ 一類(lèi)可將RNA基因組反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA并整合到宿主細(xì)胞染色體中的病毒。

▲ 分類(lèi)：兩種最常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒類(lèi)型是γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒，它們分別來(lái)自MLV和HIV-1。

▲ 適用范圍：成熟的RV可以感染多種體細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞，造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。利用活性核元件，這些載體可以只將治療基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到增殖細(xì)胞中，因此非常適合用于特異性靶向癌細(xì)胞。

▲ 裝載容量：可達(dá)8kb。

▲ 缺點(diǎn)：RV的一個(gè)重大隱患是整合酶可以將病毒的基因組插入到宿主基因組中的任何位置，可能會(huì)導(dǎo)致某些關(guān)鍵基因的失活（插入突變）或者是導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖（癌變）。

1. RV在臨床試驗(yàn)中最新進(jìn)展：

迄今為止RV載體已進(jìn)行了500多項(xiàng)基因治療的臨床試驗(yàn)，如癌癥，地中海貧血，HIV，ADA-SCID，黑素瘤，WAS等，下表羅列了目前已開(kāi)展的基于RV的重要臨床試驗(yàn)研究：

2. RV載體用于臨床試驗(yàn)存在的主要問(wèn)題和解決方案：

▲ 由于免疫反應(yīng)是RV病毒介導(dǎo)的基因治療的主要障礙，因此設(shè)計(jì)可以破壞補(bǔ)體系統(tǒng)的病毒載體至關(guān)重要。

▲ RV的LTR用作各種核蛋白的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，結(jié)合位點(diǎn)，染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和多腺苷酸化信號(hào)。因此，應(yīng)用基因工程和CRISPR技術(shù)可能規(guī)避插入突變的問(wèn)題。另外通過(guò)在治療期間使用非整合的RV載體或整合酶抑制劑也可以避免該問(wèn)題。

▲ 開(kāi)發(fā)引導(dǎo)和監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞染色質(zhì)中轉(zhuǎn)基因插入的技術(shù)也將有助于RV介導(dǎo)的基因治療。

▲ 盡管RV載體可以遞送高達(dá)10kb的轉(zhuǎn)基因序列，但高滴度病毒的制備，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及插入位點(diǎn)附近表觀遺傳的修飾仍然是臨床應(yīng)用存在的主要問(wèn)題。

▲ 由于病毒感染取決于靶細(xì)胞表面受體和病毒包膜蛋白的表達(dá)，因此設(shè)計(jì)和構(gòu)建有效組織特異性重組RV載體對(duì)于良好的臨床結(jié)果是必要的。

腺病毒載體（ADV）

▲ 第一個(gè)基因治療開(kāi)發(fā)的病毒載體，于1990年被批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)。它于1953年首次從人類(lèi)腺體組織來(lái)源的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來(lái)，因此稱(chēng)為腺病毒。含有多個(gè)家族成員，是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA（dsDNA）病毒，也稱(chēng)為腺病毒科。

▲ 分類(lèi)：ADV到目前已改進(jìn)到第三代病毒系統(tǒng)，也稱(chēng)為無(wú)病毒基因組或輔助依賴(lài)性ADV載體，缺乏除ψ和ITR序列外的所有病毒基因序列。能維持長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能力，以及較少的復(fù)制病毒顆粒的污染。其免疫原性也低于第一代和第二代載體。

▲ 裝載容量：高達(dá)37kb。

▲ 缺點(diǎn)：強(qiáng)免疫原性。

1. ADV在臨床試驗(yàn)中最新進(jìn)展：

ADV載體在整個(gè)病毒介導(dǎo)的臨床研究中的比例約24%（如上圖所示），主要集中在疫苗接種和溶瘤治療，也正被測(cè)試用于瘧疾，炭疽，HIV，流感，乙型肝炎和丙型肝炎，以及嚴(yán)重血友病以及心血管和更多疾病的臨床試驗(yàn)。下表羅列了目前已開(kāi)展的基于ADV的重要臨床試驗(yàn)研究：

2. ADV載體用于臨床試驗(yàn)存在的主要問(wèn)題和解決方案：

大量臨床試驗(yàn)得到了令人鼓舞的結(jié)果，特別是在癌癥治療中，預(yù)計(jì)ADV介導(dǎo)的基因治療不久的將來(lái)會(huì)在根除癌癥中發(fā)揮重要作用。雖然ADV介導(dǎo)的基因治療較其他系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但必須解決以下幾個(gè)問(wèn)題才能真正發(fā)揮其在臨床治療中的真正潛能：

▲ 開(kāi)發(fā)可避免內(nèi)源性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生的新型ADV是至關(guān)重要的，因?yàn)榭贵w免疫應(yīng)答的產(chǎn)生可能會(huì)使臨床操作復(fù)雜化。

▲ ADV的有效感染對(duì)于整合素和CAR蛋白在靶細(xì)胞或組織上的表達(dá)的依賴(lài)性限制了其在更多疾病中的治療前景。因此，開(kāi)發(fā)高特異性感染的新型ADV載體也是非常有必要的，以求提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)達(dá)到治療水平，誘導(dǎo)更低的器官毒性和炎癥，并且可以在體內(nèi)更加容易檢測(cè)。

▲ 了解疾病特異性生物標(biāo)志物，設(shè)計(jì)和工程化改造攜帶細(xì)胞或組織特異性受體結(jié)合表位的新型ADV衣殼也可以減少臨床副作用的產(chǎn)生。

▲ 由于ADV中和抗體的存在因患者而異，因此設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)患者個(gè)性化的特異性衣殼將是未來(lái)ADV治療疾病的趨勢(shì)。

▲ 開(kāi)發(fā)抗血清蛋白失活的ADV載體將有助于提高靜脈內(nèi)注射病毒的治療效果，但仍需要制定劑量相關(guān)毒性的解決策略。

▲ 復(fù)制感染病毒的污染仍然是治療性ADV制劑大規(guī)模生產(chǎn)中的重大問(wèn)題。因此，需要進(jìn)一步推進(jìn)ADV的純化工藝以及基于AV的基因遞送技術(shù)的研發(fā)，以充分發(fā)揮其基因治療的潛力。

腺相關(guān)病毒載體（AAV）

▲ 一類(lèi)具有單鏈和無(wú)包膜的DNA的病毒，可感染分裂和非分裂細(xì)胞。AAV以游離形態(tài)存在于細(xì)胞中的能力使它們成為基因治療的優(yōu)良候選者。這些病毒的另一個(gè)顯著特征是它們?cè)跊](méi)有腺病毒和皰疹病毒作為輔助病毒的情況下對(duì)人體不具有致病性。在沒(méi)有輔助病毒的情況下，這些病毒可以將它們的遺傳物質(zhì)插入到19號(hào)染色體上的特定位置。

▲ 分類(lèi)：AAV具有多種常見(jiàn)血清型，100多種病毒變種。不同血清型的AAV具有不同組織特異性。

▲ 裝載容量：不超過(guò)5kb。

▲ 缺點(diǎn)：人體本身就是AAV的天然宿主，因而會(huì)存在抗AAV血清型的中和抗體。有限的包裝容量限制了其在更多疾病治療中的應(yīng)用。

1. AAV在臨床試驗(yàn)中最新進(jìn)展：

目前AAV載體已被用于200多項(xiàng)臨床試驗(yàn)來(lái)治療多種疾病，占所有基因治療臨床研究的8.1%。包括A/B型血友病、先天性黑蒙癥、遺傳性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、全色盲和Leber的遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）。此外，還有許多臨床試驗(yàn)正在測(cè)試用AAV來(lái)治療溶酶體貯積癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）、癲癇、1型脊髓性肌萎縮、異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、芳香族L-氨基酸脫羧酶缺乏癥（AADC），以及巴特病等。下表羅列了目前已開(kāi)展的基于AAV的重要臨床試驗(yàn)研究：

2. 臨床試驗(yàn)研究AAV介導(dǎo)的幾類(lèi)重要疾病介紹：

▲ 癌癥基因治療：許多AAV載體正被用于測(cè)試抗血管生成，細(xì)胞毒性，細(xì)胞因子和腫瘤抑制基因，小RNA，抗原和抗體的表達(dá)來(lái)治療癌癥。大量臨床前研究顯示，使用AAV介導(dǎo)的基因治療可改善腫瘤的消退[8, 9]。

▲ 靶向肝臟基因治療：以肝臟或其他器官為目標(biāo)對(duì)AAV載體進(jìn)行的全身性血管內(nèi)給藥已在多重度遺傳病中獲得了良好的臨床結(jié)果。通過(guò)向患者體內(nèi)遞送FIX對(duì)嚴(yán)重B型血友病的成功治療被認(rèn)為是基因治療臨床應(yīng)用的里程碑[7]。在正在進(jìn)行的I / II期臨床試驗(yàn)中，F(xiàn)VIII和FIX分別被遞送給A型和B型血友病患者。另外針對(duì)粘多糖血癥的治療藥物SB-318和SB-913的I / II期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中。

▲ 視力損傷基因治療：視網(wǎng)膜作為一個(gè)相對(duì)“免疫特赦”的器官被視為載體介導(dǎo)的基因治療的理想位點(diǎn)，僅需較小的劑量就可達(dá)到最佳的效果�；�于AAV介導(dǎo)的先天性黑朦癥基因治療藥物L(fēng)uxturna™已獲批上市[4]。2019年7月，Edita公司開(kāi)展了針對(duì)先天性黑蒙癥10-型的基因治療的I / II期期臨床研究。這將有可能成為全球第一個(gè)獲批上市的基于AAV介導(dǎo)治療10-型萊伯氏先天性黑朦疾病的在體 CRISPR 基因編輯藥物[10]。

▲ 脊髓性肌萎縮基因治療：基于AAV介導(dǎo)的基因治療的另一個(gè)成功案例是脊髓性肌萎縮的治療，由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活蛋白-1（SMN1）基因突變是引發(fā)該疾病的主要原因。2019年美國(guó)美國(guó)FDA批準(zhǔn)了由Novartis公司AveXis Inc.開(kāi)發(fā)的基于AAV介導(dǎo)體內(nèi)表達(dá)SMN1蛋白的藥物Zolgensma[5]。

3. AAV載體用于臨床試驗(yàn)存在的主要問(wèn)題和解決方案：

盡管AAV載體是安全非致病的，但它們?cè)诨�因治療中的�?yīng)用受制于有限的裝載容量（不超過(guò)5Kb），衣殼蛋白引起的免疫原性，生產(chǎn)工藝?yán)щy，大劑量高度純化載體的需求，普遍的趨向性以及在人群中存在廣泛的抗AAV抗體（208-211）�；�于AAV的基因治療是目前最為安全有效的治療方式，因而優(yōu)化AAV病毒載體對(duì)于基因治療在臨床中的應(yīng)用至關(guān)重要：

▲ 由于AAV主要是衣殼與靶細(xì)胞相互接觸，因此，更好地理解T細(xì)胞對(duì)各種AAV血清型的反應(yīng)將減少炎癥、免疫應(yīng)答和其他病毒顆粒相關(guān)的副作用、設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)更多嵌合衣殼蛋白對(duì)于構(gòu)建組織特異性的病毒顆粒是至關(guān)重要的。

▲ 更好地理解AAV顆粒在疾病特異性環(huán)境中潛在的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將有助于開(kāi)發(fā)改善基因遞送效率的策略。對(duì)于患者通過(guò)免疫赦免部位（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)，粘膜表面，眼睛，胎盤(pán)，胎兒，睪丸和關(guān)節(jié)軟骨）注射AAV可能是避免T細(xì)胞反應(yīng)的更好選擇。

▲ 盡管AAV載體被證實(shí)在不整合到宿主的染色體中可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)1年的治療基因的表達(dá)，但應(yīng)用CRISPR / Cas9技術(shù)將解決長(zhǎng)期表達(dá)和誘變的問(wèn)題。

04、已上市的基因治療藥物

隨著病毒遞送載體和基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，自2003年以來(lái)，至少有十幾種基因治療產(chǎn)品問(wèn)世（如下圖所示）：

圖3. 近年來(lái)上市的基因治療藥物

1. Gendicine™是全球首個(gè)獲批的基因治療藥物，由深圳SiBiono GeneTech開(kāi)發(fā)，用于治療攜帶p53基因突變的腫瘤患者。Gendicine™是一種攜帶野生型p53基因的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-p53)，可通過(guò)刺激腫瘤細(xì)胞中的凋亡途徑，增加腫瘤抑制基因和免疫應(yīng)答因子的表達(dá)進(jìn)而殺傷腫瘤。中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2003年10月16日批準(zhǔn)了Gendicine™用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的治療[11]。

2. Oncorine™是另一種攜帶p53基因治療頭頸癌的基于復(fù)制缺陷ADV的藥物，于2005年在中國(guó)上市，由上海雙威生物科技有限公司開(kāi)發(fā)。Oncorine™是通過(guò)重組的方式刪除人5型腺病毒E1B-55kD和E3區(qū)部分基因片段而獲得的一種溶瘤性腺病毒，它可在p53功能缺陷的腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，而不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒副作用[12]。

3. Rexin-G™是一種嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，裝載有細(xì)胞殺傷性顯性負(fù)性的細(xì)胞周期蛋白G1基因以靶向并殺死實(shí)體腫瘤，于2005年獲得菲律賓FDA的批準(zhǔn)。由Epeius Biotechnologies Corporation開(kāi)發(fā)的Rexin-G™被指定為美國(guó)FDA作為胰腺癌的孤兒藥。最近的臨床研究結(jié)果證實(shí)了該藥物在安全性，抗腫瘤性以及增加患者生存時(shí)間和存活率的潛力[14]。

4. Imlygic™是一種用于治療無(wú)法通過(guò)手術(shù)去除的黑色素瘤的轉(zhuǎn)基因HSV療法，命名為T(mén)-VEC（Imlygic™），于2015年上市，是第一個(gè)也是唯一FDA批準(zhǔn)可直接注入黑色素瘤的基因藥物。T-VEC可直接殺死轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞并增強(qiáng)對(duì)它們的免疫應(yīng)答。這種先進(jìn)的溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并合成粒細(xì)胞 - 巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），從而導(dǎo)致腫瘤抗原的腫瘤裂解和釋放，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。T-VEC在歐洲和澳大利亞已被批準(zhǔn)用于黑色素瘤的治療[13]。

5. Strimvelis™[15]是另一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒用于治療超罕見(jiàn)的免疫缺陷綜合癥（ADA-SCID）的藥物，于2016年被EMA批準(zhǔn)上市。它是第一個(gè)用于治療ADA-SCID的體外干細(xì)胞基因療法，也是第二個(gè)被歐盟批準(zhǔn)上市的基因療法。Strimvelis™利用RV將ADA基因拷貝插入到患者骨髓提取的干細(xì)胞染色體中。然后將攜帶ADA基因的干細(xì)胞重新注入患者體內(nèi)并可表達(dá)腺苷脫氨酶，從而修復(fù)患者的免疫系統(tǒng)。盡管臨床結(jié)果顯示Strimvelis™針對(duì)疾病的緩解率可達(dá)100％，但目前仍?xún)A向于使用具有較低插入誘變風(fēng)險(xiǎn)的自失活逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如慢病毒載體。

6. Zalmoxis® 是另一種基于供者來(lái)源T細(xì)胞的自殺基因免疫療法，于2016年被EMA有條件性批準(zhǔn)用于治療部分白血病和淋巴瘤。該方法使用RV遺傳修飾異體來(lái)源的T細(xì)胞以表達(dá)1NGFR和HSV-TK Mut2自殺基因，因而可以隨時(shí)使用更昔洛韋（ganciclovir）藥物殺死引起不良免疫反應(yīng)的T細(xì)胞。帶有“自殺基因”的T細(xì)胞表達(dá)前藥轉(zhuǎn)換酶HSV-TK，后者可磷酸化激活更昔洛韋的細(xì)胞毒活性，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞“自殺”，防止可能出現(xiàn)的GVHD進(jìn)一步惡化[18]。

7. Kymriah™是一種基于慢病毒的嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）來(lái)治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）和B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血�。ˋLL）患者的基因療法，于2017年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。Kymriah™是一種新型免疫細(xì)胞療法，它使用患者自身重編程的T細(xì)胞編碼轉(zhuǎn)基因CAR來(lái)鑒定和消除表達(dá)CD19的惡性和非惡性腫瘤細(xì)胞，整體的治療緩解率可達(dá)83％[16]。

8. Yescarta™是另一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的CAR-T細(xì)胞免疫療法，由吉利德公司Kite開(kāi)發(fā)，并于2017年獲得FDA批準(zhǔn)。使用NHL患者自身T細(xì)胞并使用RV進(jìn)行遺傳修飾以產(chǎn)生與CD28和CD3-zeta共刺激結(jié)構(gòu)域連接的抗CD19的CAR，以幫助對(duì)抗淋巴瘤。僅在美國(guó)，約有7,500名難治性DLBCL患者有資格接受Yescarta™治療[17]。

9. Luxturna™于2017年被FDA批準(zhǔn)作為治療Leber先天性黑朦的孤兒藥，也是首個(gè)用于治療失明的基于病毒類(lèi)的藥物。攜帶有野生型RPE65的AAV2被用于治療雙等位基因RPE65突變相關(guān)的視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良的患者，可在幾個(gè)月內(nèi)恢復(fù)其視力[4]。

10. Spinraza®已成為首個(gè)批準(zhǔn)用于治療罕見(jiàn)且致命的脊髓性肌萎縮癥（SMA）的治療方法。Spinraza®是一種反義寡核苷酸（ASO），治療由5號(hào)染色體上SMN1基因突變所引起的脊髓性肌萎縮癥。Spinraza®改變SMN2前mRNA的拼接，從而增加全長(zhǎng)SMN蛋白的生產(chǎn)，可有效增加SMA患者中全長(zhǎng)SMN蛋白的數(shù)量。目前的臨床數(shù)據(jù)顯示Spinraza®在治療SMA方面的顯著療效和廣泛的適用性。此外，由Novartis公司AveXis Inc.開(kāi)發(fā)的基于AAV介導(dǎo)的在患者中表達(dá)SMN1蛋白的藥物Zolgensma已于2019年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療SMA[19]。

11. Zynteglo是由Bluebird Bio開(kāi)發(fā)的一款基于慢病毒的自體干細(xì)胞療法，于2019年獲得EMA有條件批準(zhǔn)用于治療12歲及以上的非β0 /β0基因型輸血依賴(lài)性β-地中海貧血(TDT)患者。通過(guò)慢病毒載體將具備功能的人βA-T87Q-珠蛋白基因?qū)�入到從患者體內(nèi)取出的造血干細(xì)胞中，再將這些干細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)，使患者能自主生成β-珠蛋白，從而消除或大幅降低繼續(xù)輸血治療的必要性。臨床數(shù)據(jù)顯示，該療法可以使特定基因型TDT患者免于輸血長(zhǎng)達(dá)3.8年[3]。

05、新興基因編輯技術(shù)推動(dòng)臨床發(fā)展

截至目前，基于基因療法的臨床試驗(yàn)及上市藥物主要以外源基因增補(bǔ)的方式通過(guò)病毒遞送來(lái)治療疾病，雖然這一方式取得了顯著療效，但仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)疾病長(zhǎng)期治愈的可能，這主要?dú)w因于病毒載體（如慢病毒）插入突變，ADV載體顯著的肝毒性以及AAV載體以游離態(tài)形式會(huì)隨細(xì)胞分裂增殖而丟失，或因產(chǎn)生的遲發(fā)性免疫反應(yīng)所清除等諸多因素。為了解決這一問(wèn)題，新興的以核酸內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)（如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）正被科學(xué)家們開(kāi)發(fā)用于疾病的治療。

基因編輯技術(shù)通過(guò)核酸內(nèi)切酶靶向切割基因組形成DSBs，通過(guò)NHEJ的方式產(chǎn)生Indel導(dǎo)致基因敲除，在有模板存在的條件下可通過(guò)NHEJ或HDR的方式發(fā)生靶向整合，對(duì)異�；�因進(jìn)行定點(diǎn)修復(fù)或?qū)⒅委熁�因靶向整合到基因組中，成功編輯的細(xì)胞可以傳遞給子代，以實(shí)現(xiàn)疾病的長(zhǎng)期修復(fù)效果。

隨著病毒載體和基因編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化，基于基因編輯技術(shù)的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)也陸續(xù)在進(jìn)行中，其中包括：

▲ 利用鋅指核酸酶（ZFN）治療HIV-193的臨床試驗(yàn)，以及三項(xiàng)由ZFN 介導(dǎo)治療基因體內(nèi)插入肝細(xì)胞白蛋白位點(diǎn)治療粘液多發(fā)性硬化癥I/II型和B型血友病的臨床試驗(yàn)。

▲ 針對(duì)急性髓性白血病和母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤的靶向 CD123 的同種異體 TALEN 編輯的CAR-T 細(xì)胞的早期試驗(yàn)也已經(jīng)啟動(dòng)。

▲ 最近，由Editas聯(lián)合制藥公司Allergan共同開(kāi)啟了通過(guò)AAV和CRISPR敲除CEP290內(nèi)含子突變治療10型先天性黑朦癥的1/2期臨床試驗(yàn)[10]。

另外還有許多基因編輯治療方法尚處于基礎(chǔ)研究階段，未來(lái)有希望進(jìn)入臨床來(lái)治療更多疾病�；�于基因編輯技術(shù)的拓展應(yīng)用，如表觀遺傳調(diào)控以及目前最火熱的單堿基編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用也勢(shì)必將會(huì)促進(jìn)基因編輯技術(shù)在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。

基因療法的安全性及展望

基因療法目前主要以病毒載體遞送為主，對(duì)病毒載體最為關(guān)注是免疫反應(yīng)、脫靶效應(yīng)、炎癥和插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)。免疫應(yīng)答可能使病毒治療效率降低，或者由此產(chǎn)生的抗體可能使二次給藥無(wú)效。炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是1999年高劑量腺病毒引起Jesse Gelsinger死亡的主要原因[20]。為了降低這些安全問(wèn)題，為患者量身定制病毒劑量可以更好地控制這種風(fēng)險(xiǎn)。此外，插入誘變是基因治療領(lǐng)域必須克服的主要困難。對(duì)于隨機(jī)整合的載體，例如RV，存在將基因插入腫瘤抑制基因或激活癌基因的風(fēng)險(xiǎn)。為了解決這一問(wèn)題，可以使用非整合型載體。另外，還可以制備不含自身啟動(dòng)子的自失活載體，利用細(xì)胞中的內(nèi)源啟動(dòng)子可顯著降低遺傳毒性，是傳統(tǒng)整合載體更安全的替代品。為了解決AAV包裝容量的限制，使用雙AAV載體系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)更大基因遞送的能力。

基因治療的未來(lái)會(huì)朝著更安全、更高效的載體工程方向發(fā)展，結(jié)合多種現(xiàn)有策略，如病毒載體與基因工程技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)患者進(jìn)行個(gè)性化基因治療�？傊�，基因治療的進(jìn)展為許多迄今無(wú)法治愈的疾病帶來(lái)了令人興奮的新治療機(jī)會(huì)。然而，要克服這類(lèi)新型藥物帶來(lái)的困難險(xiǎn)阻并實(shí)現(xiàn)其全部治療潛力，我們?nèi)孕枰獜?qiáng)有力且持續(xù)的合作努力。

隨著更多基因治療臨床試驗(yàn)的進(jìn)行，今后將會(huì)出現(xiàn)更多的基因治療藥物批準(zhǔn)上市，更多類(lèi)型疾病的治療將不再是夢(mèng)想。然而，我們也要認(rèn)識(shí)到目前已上市的基因治療藥物所存在的問(wèn)題，諸如審批流程復(fù)雜、價(jià)格昂貴以及需求量低等，建立合理的審批流程、制定合適的定價(jià)策略，將會(huì)為基因治療藥物的發(fā)展提供充足的保障。

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