幾十年來，DNA一直被認(rèn)為是決定生命遺傳信息的核心物質(zhì)，但是近些年不斷的研究表明，生命遺傳信息從來就不是基因所能完全決定的，比如科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，可以在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，這種改變不僅影響個體的發(fā)育，而且還可遺傳給后代。如腫瘤等多種疾病并非僅由基因突變而引起，且與DNA和組蛋白修飾等改變而引起的基因異常表達(dá)密切相關(guān)，這就是我們今天要分享的一個新領(lǐng)域——表觀遺傳學(xué)。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，目前不僅可以在DNA水平高效編輯校對，同時也可在不改變基因序列的情況下對基因進(jìn)行操縱，進(jìn)一步達(dá)到相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控目的，成為了精準(zhǔn)醫(yī)療的研究熱點(diǎn)。

何為表觀遺傳學(xué)？

遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因丟失等；而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。2018年發(fā)表在國際知名期刊NEJM（The new England journal of medicine）重磅綜述中提到，表觀遺傳學(xué)主要包括四大類[1]：

▼  DNA甲基化：它是5'端核苷酸胞嘧啶的共價修飾，通常與基因沉默有關(guān)，是表觀遺傳信息的最清晰的例子；

▼  核心組蛋白翻譯后修飾：如乙�；�，甲基化，磷酸化，泛素化等。每種修飾都與基因活性、基因沉默或活性與非活性基因區(qū)域之間的絕緣有關(guān)；

▼  高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)：包括通過染色體構(gòu)象捕獲方法揭示的環(huán)組織（即用于分析細(xì)胞中染色質(zhì)的高階組織的技術(shù)）；有組織的染色質(zhì)賴氨酸（K）修飾（LOCKs），和涉及多基因區(qū)域的核區(qū)域的核層結(jié)構(gòu)域（LAD）。

▼  非編碼RNA：如常見的siRNA,piRNA,miRNA及長非編碼RNA都屬于表觀遺傳的范疇。

大量研究表明疾病的發(fā)生與表觀遺傳學(xué)密切相關(guān)，癌癥是常見表觀遺傳疾病的范例。例如甲基化變異性的增加，與白血病和淋巴瘤中侵襲性更強(qiáng)有關(guān)，在造血系統(tǒng)腫瘤的結(jié)局預(yù)測中也有類似的觀察結(jié)果，慢性淋巴細(xì)胞白血病顯示出更高的內(nèi)部甲基化變異性。這種表觀遺傳變化，特別是表觀遺傳標(biāo)記的變異性，可能是有價值的、診斷和預(yù)后癌癥的工具。如下圖為正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在表觀遺傳上的對比：

圖1. 表觀遺傳在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的變化（來源NEJM）

基因編輯如何在表觀基因組操控？

基因編輯工具的迅速發(fā)展使得在天然染色質(zhì)環(huán)境中有針對性地進(jìn)行表觀基因組編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為可能，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展。

優(yōu)勢：能夠調(diào)控基因的表達(dá)而不會造成永久性的DNA損傷，因而不會產(chǎn)生有害突變和脫靶效應(yīng)；并且表觀遺傳療法可以通過同時調(diào)節(jié)多個基因活性來提供更好的治療效果，彌補(bǔ)基因治療存在的不足。

治療原理：目前，表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的設(shè)計(jì)主要基于核酸酶的結(jié)合運(yùn)用，其中以工程化缺陷型核酸酶（dCas9）的結(jié)合最為有效[2]。dCas9是Cas9蛋白的突變體，即Cas9蛋白的RuvC1和HNA兩個核酸酶活性區(qū)域同時發(fā)生突變。因此，dCas9蛋白的內(nèi)切酶活性完全消失，只保留由gRNA引導(dǎo)進(jìn)入基因組的能力。

圖2. dCas9示意圖[2]

CRIPSR-dCas9系統(tǒng)提供了一個研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控和進(jìn)行表觀基因組編輯的平臺，其設(shè)計(jì)原理在于把各種表觀調(diào)控效應(yīng)器融合到dCas9上，通過核酸酶的靶向并結(jié)合目標(biāo)DNA的特性實(shí)現(xiàn)特定基因組位點(diǎn)上表觀基因組的編輯。這些反式調(diào)控結(jié)構(gòu)域和蛋白是通過向啟動子區(qū)域的dCas9靶向位點(diǎn)阻礙RNA聚合酶的結(jié)合或募集內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物來發(fā)揮作用的。以下就是它的兩類主要作用模式：

第一類：dCas9融合轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄原件，通過招募轉(zhuǎn)錄因子或修飾因子起到調(diào)控作用。以下便是常用的一些基礎(chǔ)原件：

▼  常用的抑制因子：dCas9- KRAB [3-4] 。在這個系統(tǒng)中，dCas9與Kox1的轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)構(gòu)域KRAB（Kruppel-associated box）融合，這種增強(qiáng)的CRISPRi系統(tǒng)依靠KRAB招募各種各樣的組蛋白修飾因子，通過形成異染色質(zhì)的方式可逆地抑制基因表達(dá)。

▼  常用的激活因子：dCas9-VP64[5-6]。VP64是一種RNA結(jié)合蛋白，可以與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而提高基因的表達(dá)水平。

▼  除了這些因子之外，dCas9-VPR[7]和dCas9-TV[8]是比dCas9-VP64更有效的轉(zhuǎn)錄激活劑。

第二類：dCas9與表觀遺傳修飾酶來進(jìn)行融合，直接催化DNA或者組蛋白的表觀修飾，調(diào)控基因的表達(dá)。

dCas9-DNMT3A已被證實(shí)可使靶向啟動子上的DNA瞬時甲基化[9]，從而抑制基因的表達(dá)。相比之下，使用dCas9-TET1則可實(shí)現(xiàn)啟動子的快速和瞬時DNA去甲基化，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)上調(diào)[9-10]。此外，通過dCas9-PRDM9和dCas9 -DOT1L可以實(shí)現(xiàn)組蛋白穩(wěn)定的甲基化，以重新啟動表觀遺傳相關(guān)沉默基因的表達(dá)[11]。目前也有研究報道通過dCas9-LSD1誘導(dǎo)增強(qiáng)子的組蛋白脫甲基化，可下調(diào)靶基因的表達(dá)[12]。通過使用dCas9-P300[13]和dCas9-HDAC3[14]，在靶向增強(qiáng)子和啟動子區(qū)域可實(shí)現(xiàn)組蛋白瞬時高效的乙�；�和脫乙酰化，調(diào)控基因的表達(dá)。各種調(diào)控效應(yīng)器同dCas9的結(jié)合極大地擴(kuò)展了CRISPR在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀基因組編輯的應(yīng)用范圍，而相關(guān)研究也表明核酸酶的表觀基因組編輯具有極高的安全性和特異性，并且沒有明顯的脫靶效應(yīng)[3],[15]，為體內(nèi)表觀基因修飾和治療奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)心的讀者可能注意到了，CRISPR介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控與我們之前介紹過的單堿基編輯工具也是有一定的相同之處的。單堿基編輯系統(tǒng)和表觀遺傳調(diào)控系統(tǒng)都是利用了缺陷型的Cas9蛋白（前者是只產(chǎn)生nick而不產(chǎn)生DSB的nCas9，后者是完全失去內(nèi)切酶活性的dCas9），而且兩者都是通過融合蛋白來起到工作效果（前者是融合堿基編輯蛋白，后者是融合激活因子或抑制因子）。下圖是一個單堿基編輯與表觀基因組編輯的示意圖，讀者們可以感受一下其中的奧妙。

圖3. 單堿基編輯與表觀基因組編輯示意

在基因治療上的研究進(jìn)展

其實(shí)，基因組表觀遺傳修飾的異常與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展息息相關(guān)，如生活中常見的代謝紊亂、心血管疾病和癌癥等等�；�于蛋白編碼的基因研究是不足以解釋這一類疾病的發(fā)生機(jī)理的，這些疾病的發(fā)病機(jī)制主要是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳修飾改變的可逆性為治療這類疾病提供了新的希望。基因定點(diǎn)修飾技術(shù)的發(fā)展更為其精準(zhǔn)治療增加了可能。

目前利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳定點(diǎn)修飾技術(shù)在體內(nèi)治療表觀遺傳異常引起疾病的研究還屈指可數(shù)。接下來小編就帶大家回顧一下現(xiàn)有的基因編輯結(jié)合表觀遺傳治療的代表工作。

1.  常見體細(xì)胞遺傳疾病

▼  致病機(jī)理：體細(xì)胞中由于遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病。

▼  代表工作：2017年，一項(xiàng)研究采用了一種gRNA融合MS2-P65-HSF1（MPH）轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物的策略，將截短的gRNA（dgRNA）和MPH包裝到兩個單獨(dú)的AAV載體中，共同遞送到表達(dá)dCas9的轉(zhuǎn)基因小鼠中。通過靶向激活相應(yīng)的功能性基因成功地修復(fù)了I型糖尿病、急性腎損傷和肌營養(yǎng)不良的疾病表型[16]。

圖4. 通過CRISPR介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控激活體內(nèi)靶基因進(jìn)行遺傳疾病治療[16]

2.  神經(jīng)系統(tǒng)疾病

▼  致病機(jī)理：神經(jīng)細(xì)胞中由于遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病

▼  代表工作：同時另一項(xiàng)突破性的工作則使用一種SunTag（dCas9-10xGCN4）系統(tǒng)融合多個拷貝的轉(zhuǎn)錄激活蛋白（p65-HSF1），構(gòu)建了一種Cre依賴性的SunTag-p65-HSF1（SPH）轉(zhuǎn)基因小鼠模型。使用AAV8將Cre和sgRNAs遞送到SPH轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過激活內(nèi)源性神經(jīng)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在小鼠體內(nèi)成功地實(shí)現(xiàn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為功能性的神經(jīng)元[17]。這一研究表明，在不需要使用外源重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子的前提下，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控的CRISPR系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞的重編程或不同細(xì)胞類型之間的轉(zhuǎn)分化，為體外細(xì)胞基因治療遺傳疾病提供了新的策略。

圖5. Cre誘導(dǎo)的dCas9小鼠[21]

3.  單倍體劑量不足引起的疾病

▼  致病機(jī)理：單倍劑量不足(haploinsufficiency )指一個等位基因突變后，另一個等位基因能正常表達(dá)，但這只有正常水平50%的蛋白質(zhì)不足以維持細(xì)胞正常的生理功能。

▼  代表工作：近日，Science在線發(fā)表了一篇使用CRISPRa系統(tǒng)在小鼠中成功修復(fù)一種因單倍劑量不足引起的肥胖。研究人員通過AAV在SIM1基因或MC4R基因部分功能喪失的小鼠腦部遞送dCas9-vp64和sgRNA的方式成功激活了SIM1或MC4R蛋白的表達(dá)，成功抑制了肥胖的表型[18]。這一策略給罹患單倍體劑量不足引起的疾病患者帶來轉(zhuǎn)機(jī)。

圖6. 通過CRISPRa治療單倍體劑量不足相關(guān)疾病[18]

4.  異常甲基化引起的疾病

▼  致病機(jī)理：基因中CpG島中的5' C經(jīng)常突變引起高甲基化、羥甲基化等修飾，研究表明這些異常修飾會影響基因的表達(dá)調(diào)控，最終引起疾病[19]。

▼  代表工作：脆性X綜合征（Fragile X syndrome, FXS）就是一種由FMR1基因5' UTR 區(qū)中CGG三核甘酸重復(fù)序列擴(kuò)增突變并高甲基化，使FMR基因沉默而導(dǎo)致的疾病。最近的一項(xiàng)研究通過利用dCas9融合Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶1（Tet methylcytosine dioxygenase 1, Tet1）轉(zhuǎn)染FXS iPSCs 細(xì)胞系，成功靶向誘導(dǎo)FMR基因5' UTR CpG島去甲基化，為這些因異常甲基化引起的疾病的治療奠定了基礎(chǔ)[20]。

圖7. 脆性X綜合征相關(guān)疾病的表觀遺傳治療[20]

怎么樣，這次的公眾號是不是讓大家大開眼界呢？相信通過這四期的公眾號，大家已經(jīng)對基因編輯在疾病治療中的研究應(yīng)用有了較為系統(tǒng)的了解，不過“路漫漫其修遠(yuǎn)兮”，從實(shí)驗(yàn)室走到臨床還有較為漫長的距離要走。但是大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)給我們看到了未來疾病治療的新曙光，相信終有一天，基因編輯治療的大時代終會到來。

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