植物原生質(zhì)體是指脫去全部細胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生質(zhì)體融合得以完成。
本試劑盒含有除酶以外植物原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化需要的全部試劑，按照一次使用10ml酶液計算，可以使用20次。
● 貯存和效期：
   按照溫度貯存，有效期一年。
● 使用說明：
   需要準備的材料（試劑盒不提供）：
   纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細胞過濾篩；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴鍋
一、原生質(zhì)體分離：
即用型酶溶液配制

	10ml 配制量	20 ml配制量
溶液I（2×）	5 ml	10 ml
纖維素酶R-10	0.15 克	0.3 克
離析酶R-10	0.04 克	0.08 克
還原劑	5 μl	10 μl
50mg/ml BSA	0.2 ml	0.4 ml
滅菌水	定容至10 ml	定容至20 ml

注：即用型酶溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。
 
 
 
1. 取生長狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1mm的小條，按照20個葉片加10 ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，常溫酶解3小時。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態(tài)有關(guān)，請根據(jù)實驗需要適當延長酶解時間。酶溶液變?yōu)榫G色表明有原生質(zhì)體已經(jīng)分離，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。
  2. 酶解后加入10 ml溶液II，輕柔混勻。
3. 用孔徑70 μm篩網(wǎng)過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50ml離心管中。
4. 濾出液100g常溫離心 2分鐘，去除上清。
5. 加1 ml 溶液II重懸原生質(zhì)體，冰浴30分鐘（原生質(zhì)體會自然沉淀于底部）。
6. 小心去除上清溶液，不要觸動原生質(zhì)體沉淀，沉淀重懸于1 ml溶液III中即為原生質(zhì)體溶液。
二、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：
1. 取10μl質(zhì)粒DNA(濃度為1 -2μg/μl)于1.5ml 離心管中。
  2. 加入100μl原生質(zhì)體溶液，輕柔混勻。
3. 加入等體積即110μl 溶液IV-轉(zhuǎn)化溶液，輕柔徹底混勻，常溫放置15分鐘，間歇輕柔混勻。
4. 加入2倍體積即440μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉(zhuǎn)化過程。
5. 常溫100g離心2分鐘，去上清。
6. 沉淀重懸于1 ml溶液V中。
三、原生質(zhì)體培養(yǎng)和收集：
1. 原生質(zhì)體溶液 常溫（20-25℃）孵育2-16小時。
  注：根據(jù)實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標記實驗孵育2-16小時。
  2. 常溫100g離心2分鐘收集原生質(zhì)體，去除大部分上清。
3. 原生質(zhì)體沉淀重懸于剩余溶液中，-80℃貯存。