基因治療（Gene Therapy）是指將外源正�；�因?qū)�入靶�?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異�；�因引起的疾病，以達(dá)到治療目的。目前已在癌癥、遺傳性疾病如地中海貧血，鐮刀狀貧血癥、血友病及先天性黑蒙癥等多種疾病中表現(xiàn)出巨大的治療潛力�；�因治療以其一次給藥終身治愈遺傳疾病的獨(dú)特潛力讓一切不可能變?yōu)橛锌赡堋?br />
癌癥和罕見病是目前基因治療聚焦最多的領(lǐng)域
根據(jù)Pharma projects在2018年的報告[1]，目前基因治療類別主要涉及到：癌癥，單基因罕見遺傳病，心血管疾病，傳染病等，癌癥和罕見病是當(dāng)前基因治療臨床研究最多的兩個領(lǐng)域，下圖展示了截止2017年基因治療的臨床試驗(yàn)適應(yīng)癥的數(shù)目。


基因治療如何分類？
廣義的基因治療是指把某些遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)，最終達(dá)到治療某種疾病的方法。而狹義的基因治療是指將發(fā)揮正常功能的基因以修正或置換原有缺陷基因的方式以達(dá)到治療的目的。
目前基因治療主要分為以下三類，包括根據(jù)治療途徑、操作方式和靶細(xì)胞進(jìn)行分類。

一、根據(jù)載體給藥途徑可分為體內(nèi)和體外基因治療兩種（圖2）：
1. 體內(nèi)途徑（in vivo）（原位細(xì)胞基因治療）：利用非病毒或病毒載體（或是基于病毒和基于基因編輯的方式）直接將治療基因遞送到患者病患部位，從而治療疾病。這一方法操作方便，對于一些體外無法培養(yǎng)的細(xì)胞類型是最優(yōu)選擇。但由于體內(nèi)編輯的不確定性，很多隨機(jī)整合或脫靶等事件無法避免，且一些病毒載體會使機(jī)體出現(xiàn)危及生命的免疫反應(yīng)。

2. 體外途徑（ex vivo）（患者細(xì)胞離體被修飾，然后再移植回來）：直接取患者自身的病變細(xì)胞，在體外通過基因?qū)�入的方式修飾病變�?xì)胞，使其能高效表達(dá)治療型蛋白，然后體外擴(kuò)增，最后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)達(dá)到治療疾病的目的。這一方法可在利用自體細(xì)胞不會產(chǎn)生免疫排斥等免疫反應(yīng)，還可在體外篩選到高效轉(zhuǎn)導(dǎo)以及無脫靶的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)高效安全的基因治療效果。但是由于步驟繁瑣，細(xì)胞活力低等缺點(diǎn)也受到一定的局限。
體內(nèi)外基因治療的主要區(qū)別因素之一是載體的選擇（圖3）。如上所述，載體可以分為整合型載體和非整合型載體。那么如何選擇呢？
l 當(dāng)將遺傳物質(zhì)引入干細(xì)胞時，優(yōu)先使用整合型載體，這樣供體的DNA將被整合到干細(xì)胞的基因組中，在細(xì)胞分裂的過程中將被復(fù)制，從而遺傳物質(zhì)能被傳遞到所有子代細(xì)胞。
l 對于體內(nèi)基因治療而言，則通常靶向有絲分裂后的細(xì)胞。在這些細(xì)胞中，由于它們不會再分裂，只要導(dǎo)入的外源基因在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，就可以實(shí)現(xiàn)長期表達(dá)；穩(wěn)定的游離體足以驅(qū)動外源基因的細(xì)胞周期性表達(dá)。


目前大多數(shù)用于遺傳疾病的基因治療策略主要圍繞兩種載體：

1) 用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到造血和其他干細(xì)胞的慢病毒（LV）載體：如bluedird Bio公司；LentiGlobin是一種基于慢病毒載體的體外基因療法，該療法雖表現(xiàn)出極大的潛力，但是半隨機(jī)的載體整合方式，具有致癌風(fēng)險；同時慢病毒中的表達(dá)原件在造血干細(xì)胞長期歸巢和自我更新的過程中會逐漸沉默，使得療效下降，極有可能無法達(dá)到終身治愈的目的。并且這種方法需要大量病毒，即意味著巨額的花費(fèi)花費(fèi)較高。

2) 用于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到有絲分裂后細(xì)胞類型的腺相關(guān)病毒（AAV）載體：如Spark的Luxturna是2017年獲批上市的一款用于治療RPE65基因缺陷的遺傳性視網(wǎng)膜病變。通過AAV病毒攜帶正常的RPE65基因，注射入視網(wǎng)膜內(nèi)，正常的RPE65基因并不整合到人體細(xì)胞的DNA中，而是在細(xì)胞核中合成正常的RPE65蛋白，從而觸發(fā)光傳導(dǎo)通路，恢復(fù)正常的視覺功能。


二、按基因操作的方式來講分為兩類（圖4）：
1. 基因增強(qiáng)（gene augmentation）和基因失活（gene suppression）：通過導(dǎo)入外源基因使其表達(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因等的功能，不需要除異�；�因；或特異封閉某些基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，以達(dá)到抑制某些異常基因的表達(dá)。

2. 基因編輯（Genome editing），又分為基因糾正（gene correction）、基因敲除（gene knockout）和基因添加（gene addtion）：通過定點(diǎn)整合技術(shù)將外源正常的基因在特定位點(diǎn)進(jìn)行替換或插入，將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正和原位特異性修復(fù)，不涉及基因組的其他任何改變。


根據(jù)靶細(xì)胞的不同可分為體細(xì)胞和生殖細(xì)胞兩類：
1. 體細(xì)胞（Somatic cell）基因治療是指將正�；�因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。這種方法一般是將外源正常基因?qū)�入靶體細(xì)胞內(nèi)染色體特定基因座位，用健康的基因替換異常的基因，使其發(fā)揮治療作用，同時還須減少隨機(jī)插入引起新的基因突變的可能性。對基因組的定點(diǎn)整合，目前還存在很大的困難。

2. 生殖細(xì)胞（Germ cell）基因治療是將正常基因直接引入生殖細(xì)胞，以糾正缺陷基因。不僅可使遺傳疾病在當(dāng)代得到治療，而且還能將新基因傳給患者后代，使遺傳病得到根治。但生殖細(xì)胞的基因治療涉及問題較多，技術(shù)也較復(fù)雜，因此，如今更多采用的是體細(xì)胞基因治療。
以上2種方式的最大區(qū)別是否對后代產(chǎn)生影響。生殖細(xì)胞基因治療由于會將基因遺傳給后代，涉及遺傳和倫理學(xué)問題以及當(dāng)前的技術(shù)限制，生殖細(xì)胞基因治療法尚屬禁區(qū)。如2003年頒布的《人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》規(guī)定，可以以研究為目的，對人體胚胎實(shí)施基因編輯和修飾，但體外培養(yǎng)期限自受精或者核移植開始不得超過14天。因此2018年出現(xiàn)的賀建奎編輯胎兒事件屬于被明令禁止的，應(yīng)按照中國有關(guān)法律和條例進(jìn)行處理。因此在現(xiàn)有條件下，體細(xì)胞基因治療成為主要的治療方法。

基因治療的發(fā)展歷程
第一個成功的基因治療案例是通過移植基因校正的自體造血干細(xì)胞來治療原發(fā)性免疫缺陷病，盡管展現(xiàn)了良好的治療效果，但是由于整合載體的插入突變導(dǎo)致的惡性轉(zhuǎn)化和腺病毒載體試驗(yàn)中的患者死亡等不良事件的影響，導(dǎo)致基因治療一度陷入低迷期[3]。

近幾年來隨著病毒載體的優(yōu)化改造以及基因編輯技術(shù)的異軍突起，基因治療重新引來了新的曙光，主要是由于在利用體外策略（針對X連鎖脊髓損傷、腺苷脫氨酶缺乏和腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良）和體內(nèi)方法（2型Leber先天性黑蒙癥和B型血友�。┑呐R床試驗(yàn)中取得了突破性成功，如2018年底，Editas Medicine公司（張鋒創(chuàng)辦）宣布，其用于治療Leber先天性黑朦10型患者（LCA10）的基因療法（名為：EDIT-101）已經(jīng)獲得美國FDA批準(zhǔn)，EDIT-101有望成為世界上第一款在人體內(nèi)使用的CRISPR療法。EDIT-101通過視網(wǎng)膜下注射給藥，將基因編輯系統(tǒng)直接輸送到感光細(xì)胞中而達(dá)到治療效果，目前已獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床。

自2012年至今，西方國家已經(jīng)批準(zhǔn)了六種基因療法：
1) 格列貝拉是一種基于AAV的家族性脂蛋白脂肪酶缺乏療法，于2012年獲得了歐洲藥品管理局( EMA )的有條件營銷批準(zhǔn)。
2) IMLYGIC是一種基因修飾的1型單純皰疹病毒，用于黑色素瘤患者不可切除病變的局部治療，于2015年獲得美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)。
3) Strimvelis是一種基于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒的療法，用于治療腺苷脫氨酶缺乏引起的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷( ADA-SCID )，于2016年獲得EMA批準(zhǔn)。
4) 2017年，美國FDA批準(zhǔn)了三種基因療法。KYMRIAH和YESCARTA是CD19導(dǎo)向的基因修飾自體CAR T細(xì)胞免疫療法；兩者都適用于非霍奇金淋巴瘤的治療，KYMRIAH也適用于急性淋巴細(xì)胞白血病的治療。
5) LUXTURNA是一種基于AAV的基因療法，用于治療雙等位基因RPE65突變相關(guān)的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。
下圖展示了1995年-2018年期間全球注冊并開發(fā)的基因治療與臨床項(xiàng)目的數(shù)量，可以看到自2013年注冊數(shù)量快速上升，標(biāo)志著基因治療已經(jīng)進(jìn)入高速發(fā)展階段。

基因編輯技術(shù)的突破推動基因治療的發(fā)展
從上圖看到自2013年基因療法注冊數(shù)量直線上升，這很大程度歸功于基因編輯技術(shù)的突破，特別是2013年第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)被報道。其技術(shù)原理為：DNA雙鏈斷裂會誘導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制，通過精確地引入DSB將有助于外源基因的高效整合。目前可精確誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性DSB主要有四個系統(tǒng)：鋅指核酸酶( ZFNs )、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶( TALEN )、巨核酸酶，以及最近的CRISPR/Cas9系統(tǒng)（圖6）。


新一代基因編輯技術(shù)的優(yōu)勢
和傳統(tǒng)基因工程中的病毒載體相比，基因編輯技術(shù)提供了一個精準(zhǔn)的“手術(shù)剪刀”進(jìn)行基因的插入，缺失以及糾正，極大地提高了基因編輯的精準(zhǔn)性和安全性。目前，利用CRISPR/Cas9基因編輯工具已被廣泛用于臨床基因治療的應(yīng)用，核心的三大基因編輯公司（CRISPR Therapeutics、Editas Medicine和Intellia Therapeutics）也陸續(xù)上市，這些公司致力于基因治療產(chǎn)品的研發(fā)，盡管仍處于早期的發(fā)展階段，但為基因治療的臨床轉(zhuǎn)化開辟了道路。

在過去的一年里，基因治療，尤其在基因組編輯方面取得了一系列突破性的進(jìn)展，公布了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)，證明了基因治療對多種人類嚴(yán)重疾病的有效性和安全性，美國第一批基因治療藥物也獲得了FDA的批準(zhǔn)。在政府和慈善機(jī)構(gòu)的支持下，從事基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究的科學(xué)家和臨床醫(yī)生將繼續(xù)創(chuàng)新并開發(fā)更加高效安全的技術(shù)。生物技術(shù)和制藥行業(yè)也越來越多地進(jìn)軍基因治療領(lǐng)域，體現(xiàn)了這一領(lǐng)域的逐漸成熟，對于促進(jìn)基因治療的臨床轉(zhuǎn)化是必要的。然而基因治療仍然存在許多挑戰(zhàn)，包括解決整合基因遞送載體或非靶向基因組編輯的遺傳毒性，以及如何將轉(zhuǎn)基因的表達(dá)或編輯效率提高到有效的治療水平，解決體內(nèi)載體重復(fù)給藥的免疫反應(yīng)等等�；�因療法為人類疾病提供了持久治愈的可能，以過去幾年科研和臨床試驗(yàn)的成功為例，證明繼續(xù)對基因治療保持樂觀和積極的態(tài)度將有望在將來使這一療法為患者帶來福音。

參考文獻(xiàn)：
[1] Xavier M. Anguela and Katherine A. High. 2019. Entering the Modern Era of Gene Therapy. Annual Review of Medicine. Vol. 70:273-288
[2] Cox, D. B. T. , Platt, R. J. , & Zhang, F. . (2015). Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine,21(2), 121-131.
[3] Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP, et al. 2008. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J. Clin. Investig. 118:3132–42
[4] Maeder, M. L. , & Gersbach, C. A. . (2016). Genome editing technologies for gene and cell therapy. Molecular Therapy.