前言：近年來，CRISPR基因編輯技術(shù)正在席卷整個(gè)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，上一期我們已先從CRISPR系統(tǒng)開發(fā)及機(jī)制研究方面梳理了2018年相關(guān)大事件。伴隨著基礎(chǔ)技術(shù)不斷優(yōu)化，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用也更加廣泛，如動(dòng)物造模、藥物篩選、單堿基編輯技術(shù)、細(xì)胞譜系示蹤、基礎(chǔ)疾病研究、疾病診斷、體內(nèi)編輯和遺傳病校正等方面。值得一提的是，全球首例基于CRISPR的基因編輯臨床試驗(yàn)已于2018年開始實(shí)施[1]，同年12月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)Editas的一項(xiàng)利用CRISPR技術(shù)治療先天性黑朦病的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)，有望成為世界上第一種在人體內(nèi)使用CRISPR技術(shù)的療法。本期小編就先從動(dòng)物造模及單堿基技術(shù)等方面帶大家瀏覽一下近一年里CRISPR技術(shù)應(yīng)用的重大突破。



CRISPR技術(shù)的五大應(yīng)用領(lǐng)域

一、大動(dòng)物造模
CRISPR-Cas9系統(tǒng)以其簡(jiǎn)易的操作為動(dòng)物模型的構(gòu)建提供了高效的方法。目前基于CRISPR-Cas9構(gòu)建的各種人類疾病的動(dòng)物模型數(shù)以千計(jì)，主要以嚙齒類動(dòng)物（如小鼠）模型為主，其相關(guān)的發(fā)病機(jī)制和治療進(jìn)展為臨床應(yīng)用提供了許多有價(jià)值的參考。邦耀實(shí)驗(yàn)室也一直致力于相關(guān)研究，在國(guó)際知名期刊上發(fā)表多篇關(guān)于基因編輯大小鼠構(gòu)建及其在多種疾病上應(yīng)用的文章，并為廣大的科研用戶提供了數(shù)百種基因編輯動(dòng)物模型。
盡管小鼠模型可以很好地展示疾病的表征，但由于壽命和生理構(gòu)造等方面的巨大差異，對(duì)于許多神經(jīng)退行性疾病以及同年齡相關(guān)等的疾病，并不能很好地模擬許多人類疾病的相應(yīng)表征。因此，在遺傳學(xué)、解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類更接近的大型哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建顯得尤為重要。由于胚胎干細(xì)胞技術(shù)較難、繁殖周期太長(zhǎng)和基因編輯效率低等障礙，大型哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建一直都是科技攻關(guān)的難點(diǎn)。
然而，隨著CRISPR-Cas9技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)有的基因編輯工具已被證明能夠成功構(gòu)建各類大型哺乳動(dòng)物模型。2018年中國(guó)科學(xué)家在基因編輯豬和猴上做出了重要貢獻(xiàn)，在基于CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建基因編輯大型哺乳動(dòng)物模型方面引領(lǐng)了世界的腳步。
1. “基因敲入”豬：亨廷頓舞蹈病豬模型的構(gòu)建
2018年3月，來自中國(guó)的多個(gè)團(tuán)隊(duì)合作建立了一個(gè)“基因敲入”的亨廷頓舞蹈癥（HD）豬模型，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將導(dǎo)致HD的mHTT基因片段整合入豬成纖維細(xì)胞中，再通過體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得mHTT轉(zhuǎn)基因豬模型，這一研究為測(cè)試HD療法提供了一種重要的動(dòng)物模型[2]。
2. 六篇文章奠定了我國(guó)科學(xué)家在構(gòu)建基因編輯猴模型中的世界領(lǐng)先地位
l 2018年年初，中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的研究人員首次報(bào)道了，通過在胚胎細(xì)胞分化為特殊細(xì)胞時(shí)去除DNA上的化學(xué)修飾的方式，成功克服了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的體細(xì)胞克隆的限制，首次實(shí)現(xiàn)了基因克隆猴的誕生（見圖1a），標(biāo)志著非靈長(zhǎng)類動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的里程碑[3]。
l 一年后，該課題組又相繼發(fā)表兩篇文章，通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了睡眠紊亂與精神相關(guān)異常的BMAL1敲除猴[4]，隨后將BMAL1敲除猴的皮膚成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞核供體通過體細(xì)胞核移植的方法獲得了遺傳背景一致的疾病敲除猴模型（見圖1b）[5]，為非靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建及在臨床研究中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。



l 2018年1月12日，Cell Research雜志同時(shí)發(fā)表了兩篇來自中國(guó)科學(xué)家的研究工作，報(bào)道了世界首例基因敲入食蟹猴的誕生。其中來自中科院神經(jīng)科學(xué)研究所的楊輝研究組利用之前開發(fā)的一種同源末端介導(dǎo)整合(HMEJ)的方法，以胚胎原核注射方式通過優(yōu)化注射條件首次成功獲得了ACTb-T2A-mcherry基因定點(diǎn)敲入食蟹猴（見圖2），并證實(shí)這些猴子具有生殖遺傳的可能。這一研究為通過提高整合效率來構(gòu)建基因敲入猴提供了新的解決思路[6]。



另一項(xiàng)研究則由早年利用CRISPR技術(shù)成功構(gòu)建基因敲除食蟹猴的季維智院士團(tuán)隊(duì)合作完成，他們基于之前利用CRISPR-Cas9在大鼠上進(jìn)行精確基因編輯的技術(shù)進(jìn)一步拓展到食蟹猴中，成功獲得了Oct4最后一個(gè)密碼子后定點(diǎn)整合GFP的食蟹猴，并檢測(cè)到少許的錯(cuò)配以及脫靶現(xiàn)象。這項(xiàng)研究證明了靈長(zhǎng)類動(dòng)物可成功進(jìn)行精確基因編輯的可行性，為靈長(zhǎng)類動(dòng)物的重編程研究提供了一種通用的工具[7]。
l 2018年8月23日，中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞與再生創(chuàng)新研究院的研究團(tuán)隊(duì)在Nature發(fā)文，首次實(shí)現(xiàn)了在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中全身敲除SIRT6，獲得了世界上首例特定長(zhǎng)壽基因敲除的食蟹猴模型（見圖3），確定了SIRT6在非靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的生物學(xué)功能。研究的結(jié)果表明，SIRT6參與調(diào)節(jié)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的發(fā)育，SIRT6的缺乏會(huì)導(dǎo)致胎兒在子宮內(nèi)發(fā)育延遲。這一模型的建立可能為模擬和研究人圍產(chǎn)期致死綜合征的發(fā)病機(jī)制開辟了新的途徑[8]。



二、單堿基基因編輯技術(shù)的優(yōu)化
單堿基基因編輯技術(shù)是指能在基因組上引起單個(gè)堿基改變的基因編輯技術(shù)。基本原理是將胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶與現(xiàn)存Cas9n(D10A)融合而形成，依賴于CRISPR原理使得靶點(diǎn)遠(yuǎn)離PAM端的4-7位的單個(gè)堿基發(fā)生修改的基因編輯技術(shù)。單堿基編輯系統(tǒng)以其不用切割基因組就能實(shí)現(xiàn)堿基的置換而被作為目前最為安全有效的基因編輯工具，但其編輯范圍、編輯窗口、編輯效率以及特異性等未完善的問題仍然需要進(jìn)一步地改造和優(yōu)化。
1. xCas9: Cas9快速進(jìn)化系統(tǒng)擴(kuò)大堿基編輯工具靶向范圍
2018年2月，David  Liu 實(shí)驗(yàn)室在Nature發(fā)文，使用噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)進(jìn)化Cas9從而獲得了一種能識(shí)別多種PAM的SpCas9變體( xCas9 )，它可以識(shí)別包括NG、GAA和GAT在內(nèi)的多種PAM序列，可以靶向人類基因組范圍內(nèi)約1/4的靶點(diǎn)。xCas9支持在人類細(xì)胞中的多種應(yīng)用，包括靶向轉(zhuǎn)錄激活、核酸酶介導(dǎo)的基因敲除以及胞苷和腺嘌呤堿基編輯。相比spCas9，xCas9具有更高的DNA特異性，且當(dāng)用非NGG PAMs靶向基因組位點(diǎn)時(shí)，xCas9也表現(xiàn)出極低的非靶向活性。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了CRISPR系統(tǒng)的DNA靶向范圍，與ABEs 融合，也同樣使ABEs PAM的選擇更加靈活[9]。
2. dCpf1-BEs：一種能夠識(shí)別富含T的PAM的堿基編輯器
2018年5月，上�？萍即髮W(xué)陳佳實(shí)驗(yàn)室在Nature Biotechnology發(fā)文，通過將大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合到催化失活的Cpf1中，開發(fā)了一種基于CRISPR-Cpf1的dCpf1-BEs，從而克服了目前BEs僅能靶向富含G/C的PAM序列的限制，使之能夠識(shí)別富含T的PAM序列，并催化人體細(xì)胞中的C - T轉(zhuǎn)換，同時(shí)產(chǎn)生較低的編輯副產(chǎn)物，具有更高的編輯精度。這些發(fā)現(xiàn)為堿基編輯系統(tǒng)的全面深入應(yīng)用提供了新思路、拓展了應(yīng)用范疇[10]。



3. BE4max 和ABEmax：優(yōu)化堿基編輯器解決表達(dá)水平的技術(shù)瓶頸
2018年5月，David Liu實(shí)驗(yàn)室在Nature biotechnology繼續(xù)發(fā)文，認(rèn)為表達(dá)水平是堿基編輯器的技術(shù)瓶頸，通過引入核定位信號(hào)( NLS )和密碼子優(yōu)化，以及脫氨酶組分的原始重建，優(yōu)化胞苷( BE4 )和腺嘌呤( ABE7.10 )堿基編輯器，獲得了編輯效率更高的BE4max 和ABEmax，分別提高1.9倍和1.3-7.9倍。優(yōu)化的堿基編輯器可校正致病性SNPs，大大提高了在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的編輯效率[11]。
4. BE-PLUS：新型堿基編輯工具具有更寬的編輯窗口和更高的保真度
2018年 7月，陸軍軍醫(yī)大學(xué)陳潔平課題組和上�？萍即髮W(xué)黃行許課題組合作在Cell Research上發(fā)文，開發(fā)了一種新的編輯技術(shù)BE-PLUS，將10個(gè)拷貝的GCN4肽融合到nCas9 ( D10A )中，向靶位點(diǎn)招募scFv - APOBEC - UGI - GB1，從而更大范圍地進(jìn)行C to U ( T )的編輯，極大地拓展了堿基編輯器的編輯窗口。新系統(tǒng)通過擴(kuò)大窗口實(shí)現(xiàn)了堿基編輯，從而擴(kuò)大了基因組的靶向范圍，并且還能提高保真度[12]。



5. 優(yōu)化堿基編輯器實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、類器官和小鼠中的高效編輯
2018年7月，Nature biotechnology刊登了一篇新的研究，通過密碼子優(yōu)化和加入額外的核定位序列，重新設(shè)計(jì)BE3、BE4Gam和xBE3的序列。優(yōu)化篩選的組成型和誘導(dǎo)型堿基編輯系統(tǒng)極大地提高了C to T的突變效率，重新設(shè)計(jì)的堿基編輯器還能在多種小鼠和人類細(xì)胞系以及腸道器官中進(jìn)行目標(biāo)修飾，該研究還在成年小鼠肝臟中成功介導(dǎo)了有效的體內(nèi)細(xì)胞編輯。這些優(yōu)化有助于單堿基編輯工具更加高效靈活的應(yīng)用[13]。
6. eA3A-BE3：工程化人源APOBEC3A減少目標(biāo)位點(diǎn)的周邊突變
2018年 7月，哈佛大學(xué)和麻省總醫(yī)院的J. Keith Joung課題組在Nature biotechnology發(fā)文，通過使用一種工程化的人APOBEC3A (eA3A )結(jié)構(gòu)域來減少基于CRISPR - Cas9的胞苷脫氨酶周邊突變的策略，該結(jié)構(gòu)域根據(jù)一種TCR>TCY>VCN的優(yōu)先等級(jí)來對(duì)特定基序中的胞苷進(jìn)行去氨基化，極大地降低了普遍存在的五堿基對(duì)編輯窗口中存在不止一個(gè)C時(shí)，現(xiàn)有的堿基編輯器會(huì)產(chǎn)生不必要的C到 T轉(zhuǎn)換的可能。eA3A-BE3比BE3顯示更高的精度（超過40倍）以及更低的脫靶效率，且保持相似的編輯活性。利用這一系統(tǒng)他們還高效校正了人β-地中海貧血啟動(dòng)子的突變，為堿基編輯的臨床運(yùn)用提供了更高精度的編輯工具[14]。


7. hA3A-BE3:：人APOBEC3A實(shí)現(xiàn)高甲基化區(qū)域C to T的高效編輯
2018年8月，來自上�？萍即髮W(xué)和中科院的研究人員在Nature biotechnology發(fā)文，通過篩選多種APOBEC和 AID脫氨酶，發(fā)現(xiàn)人類APOBEC3A結(jié)合BEs的系統(tǒng)具有更窄的編輯窗口可以在甲基化水平和GpC二核苷酸含量高的區(qū)域高效介導(dǎo)C到T的堿基編輯，解決了目前基于大鼠APOBEC1的BEs 系統(tǒng)在編輯高度甲基化的胞嘧啶時(shí)效率相對(duì)較低的問題[15]。



8. 同期兩篇報(bào)道首次利用ABEs系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)老鼠疾病模型的構(gòu)建
2018年9月，Protein & Cell期刊刊登了兩篇利用優(yōu)化改良腺嘌呤堿基編輯器（ABE）分別在小鼠和大鼠中進(jìn)行高效的堿基編輯。文中不僅強(qiáng)調(diào)了ABEs在誘導(dǎo)A - T轉(zhuǎn)化為G - C過程中的保真度和效率，還展示了它們?cè)诋a(chǎn)生疾病模型以及糾正動(dòng)物和人類胚胎中的疾病突變方面的潛在易用性和多功能性。具體如下：
l 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院院長(zhǎng)、邦耀生物首席科學(xué)家劉明耀教授及團(tuán)隊(duì)成員李大力教授課題組，使用優(yōu)化的ABE系統(tǒng)有效地創(chuàng)建了三種小鼠品系，成功構(gòu)建了遺傳性肌肉變性疾�。―MD）的小鼠模型。另外同時(shí)構(gòu)建了II型遺傳性糖原貯積病（GSD）的大鼠模型。這是第一個(gè)通過堿基編輯系統(tǒng)在老鼠上實(shí)現(xiàn)高效點(diǎn)突變的報(bào)道。該研究不僅在疾病模型的構(gòu)建方面有很大的潛力，更重要的是在治療由點(diǎn)突變引起的遺傳性疾病方面具有重要應(yīng)用價(jià)值[16]。
l 中山大學(xué)黃軍就和松陽洲團(tuán)隊(duì)同樣適用ABEs系統(tǒng)測(cè)試了在疾病小鼠模型構(gòu)建中的有效性。通過ABE來靶向mRNA剪接位點(diǎn)以誘導(dǎo)基因功能障礙的策略成功構(gòu)建了小鼠白化病和DMD模型。這些結(jié)果表明ABEs可以有效和精確地將小鼠胚胎中的堿基A轉(zhuǎn)化為G，證明這是一種產(chǎn)生點(diǎn)突變小鼠模型的高保真工具[17]。
9. A3A-PBE：利用nCas9和人類APOBEC3A的融合，在植物中進(jìn)行高效的C to T編輯
2018年10月，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組在Nature Biotechnology上發(fā)文，展示了一種由Cas9 nickase和人APOBEC3A （A3A-PBE）組成的堿基編輯系統(tǒng)（A3A-PBE）在小麥、水稻和馬鈴薯中高效地C到T的堿基編輯。同時(shí)將尿嘧啶糖基化酶抑制劑 (UGI)和MU融合到A3A-PBE，創(chuàng)建了A3A-Gam系統(tǒng)，極大地提高了堿基編輯效率。新系統(tǒng)不僅將基于大鼠APOBEC1的BE3僅限5 nt序列編輯窗口擴(kuò)大到了17nt，而且還能有效地編輯GC含量高的區(qū)域，對(duì)于新品種培育和作物遺傳改良具有重要的應(yīng)用價(jià)值[18]。



小結(jié)
綜上，為大家簡(jiǎn)單介紹了2018年CRISPR系統(tǒng)在大動(dòng)物模型構(gòu)建和單堿基編輯技術(shù)上的重大突破。展望未來，我們可以預(yù)見CRISPR-Cas9技術(shù)將會(huì)給基礎(chǔ)科研和臨床研究帶來的突飛猛進(jìn)的發(fā)展。盡管現(xiàn)階段還沒有充分開發(fā)，但這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在生物以及醫(yī)療研究中帶來了革命性的變革，包括基因組編輯、基因篩選和細(xì)胞示蹤，疾病治療等等。關(guān)于更多重大應(yīng)用我們下期繼續(xù)介紹！

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