上一期為大家介紹了過(guò)去一年里CRISPR技術(shù)在動(dòng)物造模及單堿基技術(shù)方面取得的重大突破。本期繼續(xù)為大家從功能基因組篩選、細(xì)胞譜系示蹤及疾病診斷方面談?wù)凜RISPR-Cas系統(tǒng)的技術(shù)運(yùn)用。

一、大規(guī)模基因功能的篩選

盡管測(cè)序和基因組編輯技術(shù)取得了重大進(jìn)展，但是解析復(fù)雜的基因型-表型關(guān)系仍然是數(shù)量遺傳學(xué)的一個(gè)主要障礙。作為強(qiáng)大的基因編輯工具，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠在蛋白編碼基因的外顯子區(qū)域產(chǎn)生移碼突變而徹底破壞蛋白表達(dá)及功能，這一特性被廣泛應(yīng)用于基因的大規(guī)模功能性篩選研究，這也將大大加速評(píng)估基因變異的功能影響。

1. 利用CRISPRa構(gòu)建無(wú)偏向性的耐藥相關(guān)LncRNA篩選平臺(tái)

2018年4月Cell期刊上刊登一項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了一種開(kāi)創(chuàng)性的方法來(lái)鑒定和確定在急性髓細(xì)胞白血�。ˋML）中l(wèi)ncRNA在化療藥物產(chǎn)生耐藥性中所起的功能作用。這一技術(shù)通過(guò)結(jié)合公開(kāi)可獲得的藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息與CRISPR技術(shù)，篩選影響治療反應(yīng)的編碼基因和非編碼基因。作為一種全基因組篩查平臺(tái)，既不偏向于編碼基因，也不偏向于非編碼基因，能夠篩選到新的治療靶標(biāo)^[1]。
 

 

2. 利用一一配對(duì)的靶點(diǎn)-模板策略實(shí)現(xiàn)全基因組高效精準(zhǔn)突變

理解DNA突變體的功能效應(yīng)對(duì)于基礎(chǔ)生物學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的研究至關(guān)重要；盡管CRISPR-Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)數(shù)以千計(jì)細(xì)胞發(fā)生多基因誘導(dǎo)突變的可能，然而高通量測(cè)序這些突變體的特異性仍然是技術(shù)的瓶頸。2018年4月Nat Genet期刊刊登了一篇研究，通過(guò)改造CRISPR-Cas9系統(tǒng)，解決了目前高通量測(cè)序數(shù)以萬(wàn)計(jì)基因組編輯結(jié)果的這一壁壘，開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR的全基因組高效精確突變工程的方法。如圖所示，通過(guò)構(gòu)建10000對(duì)編碼gRNA靶向序列及其相應(yīng)的順式修復(fù)模板的質(zhì)粒文庫(kù)來(lái)實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)和模板的一一配對(duì)，將文庫(kù)遞送到酵母細(xì)胞中監(jiān)測(cè)基因突變的影響，突變效率高達(dá)95 %。這一策略可以高效精確地追蹤大量基因突變對(duì)細(xì)胞功能的影響，為研究基因的功能提供了強(qiáng)有力的分析工具^[2]。
 

 

3. Guide+donor：利用CRISPR-Cas9在酵母中高通量構(gòu)建和功能分析DNA序列變異文庫(kù)

2018年5月，哈佛基因編輯大牛Church研究組在Nature Biotechnology發(fā)文，介紹了一種基于Cas9的方法，在酵母中高效（80-100％）產(chǎn)生特定遺傳變異（缺失、替換和插入）的突變體文庫(kù)，以及整體跟蹤其適應(yīng)性的方法。使用guide+donor方法精確地剔除了酵母基因組中的315個(gè)基因，并評(píng)估和鑒定了對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性存活中起重要作用的基因。新的方法不僅能以高通量的方式在酵母菌中精確地進(jìn)行功能基因組研究，還能深入挖掘低頻基因突變及非編碼序列的基因功能，為基因功能分析打開(kāi)了新的大門(mén)^[3]。

 

4. CHAnGE：一種基于CRISPR-Cas9和同源定向修復(fù)相關(guān)的大規(guī)�；�因組篩選方法

2018年7月，美國(guó)伊利諾伊大學(xué)趙惠民研究組在Nature Biotechnology發(fā)文，開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR - Cas9和同源定向修復(fù)相關(guān)的大規(guī)�；�因組篩選方法CHAnGE，可以在全基因組范圍快速產(chǎn)生成千上萬(wàn)種精確的酵母單核苷酸突變體，追蹤基因突變對(duì)細(xì)胞的影響，突變效率超過(guò)98 %。該研究通過(guò)創(chuàng)建全基因組基因突變集合驗(yàn)證了該方法對(duì)單核苷酸分辨率基因組編輯的可行性，解決了之前的方法編輯效率局限性的問(wèn)題。該方法能夠?qū)︶劸平湍高M(jìn)行全基因組規(guī)模的快速工程化，并進(jìn)行精確和可追蹤的基因突變^[4]。

 

5. MAGESTIC：一種在酵母中可追蹤基因組條形碼的多重精確基因組編輯技術(shù)

2018年7月，美國(guó)斯坦福大學(xué)的 Steinmetz LM課題組在Nature Biotechnology發(fā)文，開(kāi)發(fā)了一種基于Cas9技術(shù)利用短的、可追蹤的整合性細(xì)胞條形碼（MAGESTIC）在釀酒酵母中進(jìn)行多重精確基因組編輯的方法。MAGESTIC使用合成的陣列g(shù)RNA-donor的寡核苷酸的質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行高通量編輯，具有基因組條形碼整合的功能，可以防止質(zhì)粒條形碼的丟失，維持穩(wěn)定的表型。利用LexA - FKH1P融合系統(tǒng)將供體DNA主動(dòng)招募到DNA斷裂部位的方法，可以提高同源重組的效率。并且相比donor融合到Cas9的方式具有更大的優(yōu)勢(shì)，一方面可以招募更多拷貝的donor，同時(shí)還不依賴(lài)于Cas9與DSBs的持續(xù)關(guān)聯(lián)。這一技術(shù)克服了目前可行方法的幾個(gè)限制，即質(zhì)粒條形碼的不穩(wěn)定性，以及在表型分析期間無(wú)法區(qū)分靶向RNA和供體模板中的Oligo合成和PCR或測(cè)序引起的錯(cuò)誤。MAGESTIC技術(shù)將廣泛用于揭示酵母表型的遺傳基礎(chǔ)^[5]。
 

 

6. 基于CRISPRi的高通量技術(shù)快速繪制人類(lèi)基因的功能圖譜

2018年7月，Cell刊登了美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的研究小組的研究成果，開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR的高通量技術(shù)快速地繪制人細(xì)胞中將近500個(gè)基因的功能圖譜，其中的許多基因之前從未被詳細(xì)地研究過(guò)。人類(lèi)目前研究過(guò)的基因還不到10％，剩余的基因功能我們還一無(wú)所知。傳統(tǒng)測(cè)試基因功能所需的方法既昂貴又耗時(shí)。開(kāi)發(fā)一種快速而又全面地確定這些未經(jīng)研究的基因功能將有助于科學(xué)家對(duì)生物學(xué)的更廣泛理解。該研究使用了一種被稱(chēng)作基因相互作用圖譜（genetic interaction mapping）的技術(shù)，用于建立對(duì)人體中基因功能的全面解析。利用一種被稱(chēng)作CRISPR抑制（CRISPRi）的工具，能夠在不編輯DNA本身的情況下降低基因活性，系統(tǒng)性地關(guān)閉單個(gè)細(xì)胞中的成對(duì)基因并測(cè)量細(xì)胞如何作出反應(yīng)，闡釋這兩個(gè)基因之間的關(guān)系，能夠快速地歸類(lèi)未知功能的基因。利用這一系統(tǒng)，研究人員鑒定出了參與細(xì)胞能量產(chǎn)生的新基因，并解釋了為何一些膽固醇藥物可用于治療骨質(zhì)疏松癥而相關(guān)藥物沒(méi)有這種效果的長(zhǎng)期謎團(tuán)。該研究最終的目的將計(jì)劃繪制整個(gè)人類(lèi)基因組中的全基因功能框架^[6]。
 

 

7. EvolvR：一種結(jié)合CRISPR和DNA聚合酶來(lái)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)特定基因進(jìn)化的平臺(tái)

2018年8月，加州大學(xué)伯克利分校創(chuàng)新基因組學(xué)研究所在Nature上發(fā)文，提出了一種可以利用自然進(jìn)化力量的變革性新方法---一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)特定基因進(jìn)化的平臺(tái)。他們將這個(gè)新系統(tǒng)命名為“EvolvR”，這一系統(tǒng)是將Cas9同一種DNA聚合酶融合，利用一種nicking-Cas9只切割兩條DNA鏈中的一條，形成的特殊切口會(huì)通過(guò)聚合酶補(bǔ)齊。DNA聚合酶補(bǔ)齊的過(guò)程會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤，導(dǎo)致出現(xiàn)各種不同類(lèi)型的突變。因此聚合酶這種錯(cuò)誤能帶來(lái)更多的基因多樣性，利用EvolvR人為地制造隨機(jī)突變，創(chuàng)造數(shù)百萬(wàn)種不同的序列組合，從中發(fā)現(xiàn)許多人為需要的突變物種。這一系統(tǒng)甚至可以實(shí)現(xiàn)在一次實(shí)驗(yàn)中得到數(shù)千種不同的基因多樣化，創(chuàng)造出全新的功能，而不僅僅是打開(kāi)和關(guān)閉基因^[7]。

 

8. Pro – Codes：利用蛋白質(zhì)條形碼技術(shù)高分辨率分析數(shù)百種基因功能的系統(tǒng)

2018年10月，上來(lái)自西奈山醫(yī)院的研究人員在Cell期刊發(fā)文，開(kāi)發(fā)了一種在蛋白質(zhì)水平上的條形碼系統(tǒng)( Pro - Codes)，使用線性表位的組合來(lái)創(chuàng)建更高倍數(shù)的蛋白質(zhì)條形碼，可以同時(shí)分析數(shù)百種基因功能，分辨率可達(dá)單細(xì)胞水平。利用合成蛋白“抗原決定簇（epitopes）”標(biāo)記和追蹤不同的CRISPRs，Pro-codes能同時(shí)兼容數(shù)百個(gè)CRISPRs以敲除大量基因，并通過(guò)質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行分析。目前利用DNA作為條形碼的基因篩選技術(shù)僅能實(shí)現(xiàn)有限的表型和粗略的細(xì)胞分辨率。新型Pro-Codes技術(shù)能夠以單細(xì)胞分辨率同時(shí)對(duì)100個(gè)基因進(jìn)行高維蛋白質(zhì)水平的表型分析，可以更全面地描述單個(gè)基因的生物學(xué)效應(yīng)^[8]。
 

 

9. 通過(guò)CRISPR-Cas9靶向剪切位點(diǎn)來(lái)全基因組篩選功能性LncRNA新策略

2018年11月，為彌補(bǔ)之前建立的基因組大片段刪除、CRISPRi和CRISPRa等方法進(jìn)行l(wèi)ncRNA的高通量功能性篩選在效率、質(zhì)量（假陽(yáng)性、假陰性）上的不足，北大魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志發(fā)文提出了一種新的篩選策略，通過(guò)構(gòu)建特異性靶向基因的剪接位點(diǎn)的新型CRISPR文庫(kù)，以高通量的方式產(chǎn)生基因的外顯子缺失或者內(nèi)含子滯留。運(yùn)用這一策略，實(shí)現(xiàn)了全基因組水平上對(duì)lncRNA功能的高效篩選，篩選并發(fā)現(xiàn)了230個(gè)lncRNA與細(xì)胞存活或增殖相關(guān)。并通過(guò)進(jìn)一步分析表明，lncRNA功能在不同細(xì)胞種類(lèi)中具有顯著異質(zhì)性。這一新型高通量技術(shù)平臺(tái)的建立，首次真正實(shí)現(xiàn)了從全基因組水平對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA進(jìn)行基于完全敲除的高通量篩選，該方法學(xué)將為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和解析lncRNA功能提供有效工具^[9]。
 

10. SLICE：一種利用Cas9蛋白電穿孔進(jìn)行單向?qū)�RNA慢病毒感染的系統(tǒng)

2018年11月，來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的研究人員在Cell期刊發(fā)文，提出一種基于CRISPR的篩選工具-SLICE，一種利用Cas9蛋白電穿孔進(jìn)行單向?qū)�RNA慢病毒感染的系統(tǒng)�；�于sgRNA慢病毒文庫(kù)的傳統(tǒng)CRISPR篩選技術(shù)因慢病毒載體編碼Cas9蛋白時(shí)間太長(zhǎng)對(duì)于體外培養(yǎng)時(shí)間有限的原代T細(xì)胞來(lái)說(shuō)受到限制，而SLICE系統(tǒng)將通過(guò)將sgRNA慢病毒文庫(kù)與Cas9蛋白電穿孔相結(jié)合的方式，能夠快速導(dǎo)入患者的原代T細(xì)胞中并評(píng)估各個(gè)基因的功能。這種新方法能夠?yàn)槊庖呒?xì)胞抗癌的改造以及其他疾病的指導(dǎo)提供強(qiáng)有力的依據(jù)^[10]。
 

 

二、DNA標(biāo)記與細(xì)胞譜系示蹤

發(fā)育生物學(xué)的重點(diǎn)包括構(gòu)成器官或生物體的細(xì)胞類(lèi)型的多樣性以及這些細(xì)胞的發(fā)育譜系歷史。這些方面通常作為一個(gè)方向被單獨(dú)研究，但最近的四篇新論文報(bào)道了一種將單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）技術(shù)與基于CRISPR的譜系示蹤技術(shù)相結(jié)合來(lái)同時(shí)解剖轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞表型和譜系歷史的方法。近些年來(lái)CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)已被證明可用于細(xì)胞譜系示蹤^[11]。在經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方案中，條形碼陣列被設(shè)計(jì)到生物體的基因組中；在胚胎發(fā)育的早期階段，胚胎共注射Cas9和導(dǎo)向RNA（gRNA）靶向切割條形碼陣列。在CRISPR編輯期間，條形碼在不同細(xì)胞中以可變的方式被累積切割和修復(fù)。隨后在特定的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)對(duì)條形碼序列進(jìn)行分析，就可以從已有的Cas9誘導(dǎo)的突變類(lèi)型中推斷出細(xì)胞之間的譜系關(guān)系。
 

1. 三項(xiàng)標(biāo)志性研究通過(guò)利用scRNA-seq提供的細(xì)胞類(lèi)型信息來(lái)研究斑馬魚(yú)的發(fā)育過(guò)程，展示CRISPR系統(tǒng)在細(xì)胞譜系示蹤中的可行性

l Alemany等人開(kāi)發(fā)了一種被稱(chēng)為ScarTrace的方法，這一方法是在Cas9 蛋白或RNA同靶向GFP的gRNA一起注射胚胎后，靶向八個(gè)串聯(lián)拷貝的GFP基因的轉(zhuǎn)基因基因組簇。對(duì)分化后的組織進(jìn)行scRNA-seq分析，該團(tuán)隊(duì)使用一種分選和自動(dòng)化輔助的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（SORT-seq）方案。盡管Cas9編輯的GFP序列（'傷疤'）通常在細(xì)胞中表達(dá)，因此可以從轉(zhuǎn)錄組中讀出，但SORT-seq結(jié)合了巢式PCR步驟，從單個(gè)細(xì)胞中的剩余基因組DNA中讀出瘢痕序列，從而最大程度地減少缺乏GFP表達(dá)的細(xì)胞的譜系信息的丟失。研究人員分析了各種組織的克隆歷史 - 包括造血系統(tǒng)，成體大腦和眼睛以及再生鰭 - 以提供各種發(fā)育信息，例如作為特定分化細(xì)胞亞群前體的祖細(xì)胞的數(shù)量和類(lèi)型^[12]。

l Spanjaard等人則報(bào)告了一種概念上同前者類(lèi)似的譜系追蹤方法，通過(guò)核酸酶激活來(lái)編輯普遍存在的序列（LINNAEUS），讓人們能夠確定細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞譜系。該方法涉及胚胎注射Cas9蛋白和靶向16-32個(gè)遍布基因組的紅色熒光蛋白（RFP）基因的整合位點(diǎn)的gRNA。使用基因組分散的靶序列的基本原理是避免附近的陣列拷貝之間的刪除，這可能會(huì)刪除它們之間的含大量信息的拷貝。LINNAEUS適用于斑馬魚(yú)幼體，以及成體心臟，肝臟，胰腺和大腦。該團(tuán)隊(duì)使用基于液滴的微流體進(jìn)行scRNA-seq，突變的RFP序列從轉(zhuǎn)錄組中讀出，并被分成一個(gè)用于轉(zhuǎn)錄組范圍分析的文庫(kù)和一個(gè)靶向分析RFP序列的文庫(kù)。除了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，Spanjaard等人突出了生物信息學(xué)的挑戰(zhàn)和對(duì)定制分析方法的需求，因?yàn)槲锓N進(jìn)化研究得出的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)發(fā)育算法對(duì)細(xì)胞譜系重建來(lái)說(shuō)并不是最理想的，主要是由于需要大量（數(shù)萬(wàn)）的單細(xì)胞比較和譜系條碼不能完整的檢測(cè)出來(lái)^[13]。

l 第三項(xiàng)研究中，Raj等人著重探索如何克服胚胎注射Cas9僅在發(fā)育的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)有效的限制。因此，除了胚胎注射Cas9蛋白和4個(gè)靶向RFP條形碼的1-4位點(diǎn)的gRNA之外，斑馬魚(yú)還同時(shí)轉(zhuǎn)基因編碼Cas9和另外5個(gè)靶向RFP條形碼5-9位點(diǎn)的gRNA，這些gRNA均可通過(guò)熱誘導(dǎo)在特定的時(shí)間表達(dá)來(lái)監(jiān)測(cè)后期發(fā)育的階段。這一方法被稱(chēng)為scGESTALT（一種基于之前報(bào)道的GESTALT示蹤方法的單細(xì)胞衍生技術(shù)），scRNA-seq同Spanjaard等人類(lèi)似，使用基于液滴的微流體技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組的靶向富集來(lái)測(cè)序條形碼。 Raj等人的分析主要集中在大腦上，確定了神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型之間的許多譜系關(guān)系以及發(fā)育轉(zhuǎn)變期間可能的基因表達(dá)關(guān)系^[14]。這些強(qiáng)大的細(xì)胞示蹤技術(shù)可用于研究各種正常和病理的發(fā)育現(xiàn)象，還可用于其他模式生物。
 

2. “創(chuàng)始小鼠（founder mouse）”為CRISPR系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞譜系示蹤創(chuàng)造可能

上述研究在細(xì)胞和低等脊椎動(dòng)物中證實(shí)了CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)在細(xì)胞譜系示蹤中應(yīng)用的可行性。然而，目前還沒(méi)有在老鼠身上進(jìn)行驗(yàn)證，老鼠是一種在許多方面（如發(fā)育方面）與人類(lèi)健康更相關(guān)的模式生物。小鼠發(fā)育過(guò)程較長(zhǎng)，以及在其整個(gè)發(fā)育過(guò)程中分化成眾多譜系，因而需要持續(xù)生成高度多樣化的條形碼，最大限度地減少不必要的重寫(xiě)事件，以最大限度地提高成功記錄重要事件的幾率。

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自哈佛大學(xué)George Church課題組通過(guò)構(gòu)建了一種含有多個(gè)獨(dú)立的條形碼位點(diǎn)分散陣列（hgRNAs）的“創(chuàng)始小鼠”，將創(chuàng)始小鼠與表達(dá)Cas9蛋白的小鼠雜交，子代小鼠因?yàn)閔gRNA會(huì)在整個(gè)妊娠期隨機(jī)累積突變，在每個(gè)譜系中產(chǎn)生獨(dú)特的突變，并且不會(huì)刪除早期的突變，使得相關(guān)的細(xì)胞具有更加相似的突變譜或條形碼。在發(fā)育條形碼小鼠中，廣泛表征每種hgRNA的活性譜和突變等位基因，并在發(fā)育早期對(duì)譜系樹(shù)進(jìn)行自下而上的后期重建，從其根部的第一個(gè)分支開(kāi)始，并追蹤細(xì)胞的原始譜系。這一研究為哺乳動(dòng)物模型中的體內(nèi)條形碼和譜系追蹤提供了一個(gè)可行的通用平臺(tái)系統(tǒng)^[15]。
 

 

三、基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的疾病診斷技術(shù)

快速分子診斷技術(shù)在許多領(lǐng)域非常有用，包括公共衛(wèi)生、環(huán)境檢測(cè)和刑事偵查等�；�于CRISPR開(kāi)發(fā)的體外診斷技術(shù)入選2018年世界十大科技進(jìn)展。CRISPR-Cas系統(tǒng)現(xiàn)已被證明可特異性地識(shí)別并切割DNA和RNA，這暗示了該系統(tǒng)作為通用核酸識(shí)別工具的潛在用途。由于靶序列和CRISPR-Cas系統(tǒng)之間識(shí)別的特異性，CRISPR-Cas系統(tǒng)已被用于檢測(cè)點(diǎn)突變或單核苷酸變體。這項(xiàng)技術(shù)能夠通過(guò)分析病原體的DNA或RNA來(lái)檢測(cè)感染過(guò)程中的病原體。下面列舉了今年以來(lái)CRISPR-Cas系統(tǒng)在分子診斷方面取得的重大突破（如下圖所示）。

 

1. 基于Cas13的分子檢測(cè)系統(tǒng)

自2017年張鋒團(tuán)隊(duì)利用Cas13a (以前稱(chēng)為C2c2 ) 在靶識(shí)別時(shí)表現(xiàn)出混雜核糖核酸酶活性的“附帶效應(yīng)”與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合，建立了基于CRISPR的診斷方法( CRISPR-Dx )，一種具有同向敏感性和單堿基錯(cuò)配特異性的快速DNA或RNA檢測(cè)技術(shù)---SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）診斷平臺(tái)，可用于檢測(cè)寨卡病毒和登革病毒、細(xì)菌分離物、抗生素抗性基因、人類(lèi)DNA基因型和癌癥突變等^[17]。之后不久，該團(tuán)隊(duì)對(duì)SHERLOCK診斷平臺(tái)進(jìn)行一系列優(yōu)化，成功開(kāi)發(fā)了SHERLOCKv2系統(tǒng)，該系統(tǒng)集成了四種正交的CRISPR-Cas酶，是目前唯一可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶向位點(diǎn)的檢測(cè)系統(tǒng)，突出其多向、便攜、快速和定量核酸檢測(cè)平臺(tái)的潛力^[18]。同時(shí)，他們也進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）系統(tǒng)，與SHERLOCK相輔相成，用于直接從體液中檢測(cè)病毒，能夠在不用任何儀器的情況下在不到2小時(shí)內(nèi)直接從患者樣品中進(jìn)行檢測(cè)，極大地提高了分子檢測(cè)的便利性^[19]。
 

 

 

2. 基于Cas12的分子檢測(cè)系統(tǒng)

l Jennifer A. Doudna團(tuán)隊(duì)也通過(guò)將Cas12a (CpfI)與分子信號(hào)槍相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了靈敏而又準(zhǔn)確的DNA檢測(cè)。這種方法被稱(chēng)作DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）。這一方法的基礎(chǔ)在于發(fā)現(xiàn)Cas12a在靶向到DNA靶標(biāo)后具有切割附近所有單鏈DNA的功能，開(kāi)發(fā)人員利用一種熒光分子通過(guò)單鏈DNA與另一種抑制這一熒光分子發(fā)光的抑制分子連接在一起。在Cas12a切割單鏈DNA后將會(huì)移除一直分子，從而讓這一熒光分子發(fā)光。利用這一技術(shù)，他們成功對(duì)致癌性HPV病人樣品進(jìn)行了正確的判斷^[20]。同時(shí)我國(guó)王金課題組在3月12日的Cell Research雜志上也發(fā)表了題為CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA的研究論文，同前期Jennifer Doudna課題組發(fā)表的的研究結(jié)果類(lèi)似，系統(tǒng)地研究了Cas12a對(duì)于靶標(biāo)ssDNA和非靶標(biāo)ssDNA的切割特性^[21]。

l 此外，上海吐露港的研究團(tuán)隊(duì)在2017年基于對(duì)側(cè)鏈單鏈DNA具有反式切割活性的Cas12a開(kāi)發(fā)的一種高效、靈敏和特異的檢測(cè)DNA、RNA病毒和人的SNP的平臺(tái)HOLMES (one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)^[22]。隨后于2018年年底，該團(tuán)隊(duì)將同樣具有ssDNA反式切割活性的嗜熱性Cas12b與LAMP介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增( LAMP )相結(jié)合，創(chuàng)建了改進(jìn)版的HOLMESv2。在HOLMESv2中，LAMP擴(kuò)增和Cas12b反式切割可以整合到一個(gè)恒溫的一步系統(tǒng)中，因此為核酸檢測(cè)帶來(lái)了極大的便利。同時(shí)他們還簡(jiǎn)化了HOLMESv2中的RNA檢測(cè)程序，使用RNA依賴(lài)性DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，因此省略了額外的逆轉(zhuǎn)錄步驟，這是迄今為止最簡(jiǎn)單的用于RNA檢測(cè)的CRISPR生物傳感系統(tǒng)^[23]。
 

 

小結(jié)：

綜上為大家介紹了CRISPR/Cas9在2018年重大機(jī)制進(jìn)展和諸多方面的應(yīng)用，可以看到基礎(chǔ)科學(xué)家已經(jīng)在利用CRISPR-Cas9技術(shù)理解和操縱生物學(xué)方面取得了巨大進(jìn)展，在臨床上，我們可以期待基因疾病的新療法（如利用Cas9基因編輯或CRISPRi/a）和新的診斷技術(shù)。我們能夠利用大自然的技術(shù)工具箱，通過(guò)進(jìn)化改造更多高效且安全的基因編輯工具為我們所用。新的CRISPR系統(tǒng)或許就隱藏在我們周?chē)�生物體的基因組中，未來(lái)可能會(huì)出現(xiàn)更多具有新的機(jī)制和功能的CRISPR衍生物，將會(huì)為人類(lèi)提供強(qiáng)大的突破性技術(shù)。

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Bester, Assaf C., et al. "An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance." Cell173.3(2018):649-664.e20.

[2] Sadhu, M. J., et al. "Highly parallel genome variant engineering with CRISPR-Cas9. " Nature Genetics50.4(2017):510.

[3] Guo, Xiaoge, et al. "High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast." Nature Biotechnology (2018).

[4] Bao, Zehua, et al. "Genome-scale engineering of Saccharomyces cerevisiae with single-nucleotide precision." Nature Biotechnology (2018).

[5] Roy, K. R., et al. "Multiplexed precision genome editing with trackable genomic barcodes in yeast." Nature Biotechnology (2018).

[6] Horlbeck, Max A., et al. "Mapping the Genetic Landscape of Human Cells." Cell (2018): S0092867418307359-.

[7] Halperin, Shakked O., et al. "CRISPR-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window." Nature (2018).

[8] Wroblewska, A, et al. "Protein Barcodes Enable High-Dimensional Single-Cell CRISPR Screens." Cell175.4(2018):1141.

[9] Liu, Ying, et al. "Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites." Nature Biotechnology (2018).

[10] Shifrut E, et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Cell. 2018 Dec 13;175(7): 1958-1971.e15.

[11] Kalhor, Reza, P. Mali, and G. M. Church. "Rapidly evolving homing CRISPR barcodes." Nature Methods 14.2(2016):195-200.

[12] Alemany, A. et al. Whole-organism clone tracing using single-cell sequencing. Nature 556, 108–112 (2018)

[13] Spanjaard, Bastiaan, et al. "Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars." Nature Biotechnology (2018).

[14] Raj, Bushra, et al. "Simultaneous single-cell profiling of lineages and cell types in the vertebrate brain." Nature Biotechnology (2018).

[15] Reza, Kalhor, et al. "Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR." Science (2018): eaat9804-.

[16] YiLi et al., CRISPR/Cas Systems towards Next-Generation Biosensing. Trends Biotechnol (2018).

[17] Gootenberg, Jonathan S., et al. "Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2." Science 356. 6336 (2017):438-442.

[18] Myhrvold, Cameron, et al. "Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13." Science 360.6387(2018):444-448.

[19] Gootenberg, Jonathan S., et al. "Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6." Science 360.6387(2018):eaaq0179.

[20] Chen, Janice S. , et al. "CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity." Science (2018):eaar6245.

[21] Li, Shi Yuan, et al. "CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA." Cell Research (2018).

[22] Cheng, Q.X. et al. Shanghai Tolo Biotech Co.,Ltd. An application of a Cas protein, and a method and kit for detecting a target nucleic acid molecule, (2017) CN107488710A

[23] L. Li, S. Li, J. Wang, CRISPR-Cas12b-assisted nucleic acid detection platform. bioRxiv, (2018).