研究背景：

電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛認(rèn)可，但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的確切靶點(diǎn)和細(xì)胞特異性的鎮(zhèn)痛機(jī)制仍然沒有得到充分的認(rèn)識(shí)。［1-3］。已有研究證實(shí)，電針可以誘導(dǎo)c-fos在中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray, PAG）中特異性表達(dá)［4］，腹外側(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(ventrolateral periaqueductal gray, vlPAG)是介導(dǎo)疼痛調(diào)節(jié)的神經(jīng)通路的重要組成部分［5］。

內(nèi)源性鎮(zhèn)痛物質(zhì)阿片肽和大麻素通過間接抑制局部GABA能中間神經(jīng)元的抑制效應(yīng)來激活下行通路，因此使輸出神經(jīng)元對脊髓的痛覺信息傳遞產(chǎn)生去抑制作用［6］。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中控制疼痛傳導(dǎo)和針刺鎮(zhèn)痛的重要神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其介導(dǎo)的抗傷害作用在下行抑制性鎮(zhèn)痛通路的激活中起到重要作用［7-8］。 

vlPAG中的GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元在傷害性信息處理中起著重要而又復(fù)雜的作用。在vlPAG中微量注射谷氨酸激動(dòng)劑或GABA拮抗劑可以產(chǎn)生顯著的抗傷害性刺激效應(yīng)［9,10］。大麻素受體1(Cannabinoid receptor 1, CB1)在PAG中GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元的神經(jīng)末梢均有表達(dá)，CB1受體的激活可能調(diào)節(jié)GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元的傳遞［11-12］。之前的研究結(jié)果表明，CB1受體參與電針鎮(zhèn)痛［13］。那么vlPAG中GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元是否參與CB1受體介導(dǎo)的電針鎮(zhèn)痛呢？

2019年5月17日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系李熳團(tuán)隊(duì)在《Frontiers in Neuroscience》上在線發(fā)表了題為“Inhibition of GABAergic Neurons and Excitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor”的文章。該研究發(fā)現(xiàn)了電針通過CB1受體激活vIPAG中GABA能神經(jīng)元和抑制谷氨酸能神經(jīng)元而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，vIPAG中GABA能神經(jīng)元上的CB1受體是電針鎮(zhèn)痛的重要靶點(diǎn)。該研究為電針能夠通過CB1受體雙向調(diào)控vIPAG中的GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

電針能有效降低CCI和KOA小鼠的疼痛敏感性

首先，團(tuán)隊(duì)對小鼠采用與大鼠坐骨神經(jīng)慢性損傷（CCI）［14］類似的方法，使其產(chǎn)生神經(jīng)病變來制備CCI模型；采用左膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射碘酸單鈉（MIA）來誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）模型。通過電針治療CCI和KOA小鼠，發(fā)現(xiàn)電針顯著增加其機(jī)械痛閾值和熱痛閾值（圖1A-D）。并且在條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)中，小鼠在與電針治療進(jìn)行條件性配對后，逗留在明箱的時(shí)間顯著增加（圖1E-H）。

 

圖1.電針能有效降低CCI和KOA小鼠的疼痛敏感性

抑制vlPAG中GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)

課題組為了驗(yàn)證抑制vlPAG中的GABA能神經(jīng)元是否可以發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，應(yīng)用了化學(xué)遺傳學(xué)策略，將rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gi)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG的右側(cè)，目的是特異性的抑制GABA能神經(jīng)元的活動(dòng) (圖 2A)。這種病毒混合物同樣注射到GAD67-GFP小鼠的右側(cè)vlPAG區(qū)，用來驗(yàn)證病毒的轉(zhuǎn)染效率(圖2B, C)。vlPAG中約有80.5%標(biāo)記上的神經(jīng)元和GAD67-GFP陽性神經(jīng)元共定位(圖 2D)。

 

圖2.病毒混合物標(biāo)記率 

隨后，化學(xué)遺傳抑制CCI和KOA小鼠GABA能神經(jīng)元，能有效地模擬電針的效應(yīng)，包括鎮(zhèn)痛效應(yīng)(圖3A–H).

 

圖3.VlPAG中GABA能神經(jīng)元的化學(xué)遺傳抑制能模擬EA的效應(yīng)

激活vlPAG中GABA能神經(jīng)元只能部分減弱電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

接下來，為了驗(yàn)證激活GABA能神經(jīng)元是否能翻轉(zhuǎn)電針的鎮(zhèn)痛的效應(yīng)。團(tuán)隊(duì)將rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG中以達(dá)到激活GABA能神經(jīng)元的目的。

意外地發(fā)現(xiàn)，激活vlPAG中GABA能神經(jīng)元后只能部分降低電針治療組小鼠的機(jī)械痛閾值和熱痛閾值(圖 4A-D)，同時(shí)也只能部分降低條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)中小鼠待在明箱的時(shí)間（圖4E-H）。

 

圖4.vlPAG中GABA能神經(jīng)元的化學(xué)激活僅部分減弱了EA的效應(yīng)

激活vlPAG中GABA能神經(jīng)元和抑制谷氨酸能神經(jīng)元可以有效拮抗電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

單獨(dú)激活GABA能神經(jīng)元只能部分的減弱電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，為了驗(yàn)證GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元都參與了電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。研究團(tuán)隊(duì)在vlPAG中GABA能神經(jīng)元被激活的基礎(chǔ)上，另外使用rAAV-CaMKIIa-HA-KORD-IRES-mCitrine-WPRE-pA病毒來選擇性抑制vlPAG中的谷氨酸能神經(jīng)元的活動(dòng)。發(fā)現(xiàn)激活vlPAG中的GABA能神經(jīng)元并抑制vlPAG中的谷氨酸能神經(jīng)元可以大幅降低小鼠的機(jī)械縮腿閾值和熱痛閾值(圖5A-D)，以及在條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)中明箱逗留的時(shí)間(圖 5E-H)。

 

圖5.vlPAG中的GABA能神經(jīng)元的化學(xué)激活與VlPAG中谷氨酸能神經(jīng)元的化學(xué)抑制相結(jié)合能有效地減弱電針的效應(yīng)

GABA能神經(jīng)元上的CB1受體參與了電針對疼痛超敏反應(yīng)的作用

接下來，為了驗(yàn)證vlPAG中GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元的軸突上表達(dá)的CB1受體是否參與電針的鎮(zhèn)痛作用。研究人員在賽業(yè)生物構(gòu)建的mCnr1flox/flox小鼠右側(cè)vlPAG中注射了rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒，特異性敲除vlPAG中GABA能神經(jīng)元上的CB1受體；在mCnr1flox/flox小鼠右側(cè)vlPAG中注射rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA病毒，特異性敲除vlPAG中谷氨酸能神經(jīng)元上的CB1受體(圖6A, C)。

 

圖6.特異性敲除位于vlPAG內(nèi)的GABA能神經(jīng)元上的CB1受體

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，特異性敲除GABA能神經(jīng)元上的CB1受體可以消除電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，顯著降低了機(jī)械痛閾值和熱痛閾值(圖 7A-D)以及在條件性位置偏愛實(shí)驗(yàn)中明箱的逗留時(shí)間（圖7E-H）。特異性敲除vlPAG中谷氨酸能神經(jīng)元上的CB1受體僅輕微地減弱電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果表明，vlPAG中位于GABA能神經(jīng)元上的CB1受體才是電針發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)的基礎(chǔ)。

 

圖7.特異性敲除GABA能神經(jīng)元CB1受體消除電針對疼痛反應(yīng)敏感的效應(yīng)

總而言之，該研究證明了vlPAG中GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元在電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的新機(jī)制，即電針可以通過CB1受體同時(shí)抑制vlPAG中GABA能神經(jīng)元和激活vlPAG中谷氨酸能神經(jīng)元來發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。特異性敲除GABA能神經(jīng)元上的CB1受體能夠完全消除電針的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而只有激活vlPAG中的GABA能神經(jīng)元聯(lián)合抑制vlPAG中的谷氨酸能神經(jīng)元才能夠完全翻轉(zhuǎn)電針的鎮(zhèn)痛作用。電針能夠通過CB1受體在GABA能系統(tǒng)和谷氨酸能系統(tǒng)上同時(shí)發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能。這項(xiàng)研究可能為臨床疼痛治療和鎮(zhèn)痛藥物的發(fā)展提供了一個(gè)新的思路。

作者簡介：

李熳，1973年出生，博士、教授、碩士研究生導(dǎo)師、博士研究生導(dǎo)師。湖北省神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)副秘書長、武漢市針灸學(xué)會(huì)常務(wù)理事。evidence-based complementary and alternative medicine 雜志編委。

1995年6月畢業(yè)于湖北中醫(yī)學(xué)院，獲得針灸專業(yè)醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位；1998年6月畢業(yè)于湖北中醫(yī)學(xué)院，獲得針灸專業(yè)醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位；2001年6月在原同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系獲得中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，作為主要參加人員完成導(dǎo)師為關(guān)新民教授的國家自然科學(xué)基金課題 (no.39970889)，對電針治療炎性痛時(shí)“氣至病所” 的外周機(jī)制進(jìn)行了一系列的研究，掌握了經(jīng)絡(luò)實(shí)質(zhì)和針刺鎮(zhèn)痛原理研究的前沿知識(shí)，并積累了豐富的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)；2001年7月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系留校任講師； 2003年7月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系任副教授； 2006年3月－2007年9月在澳大利亞新南威爾士大學(xué)解剖學(xué)系進(jìn)修一年半，研究外周補(bǔ)體參與神經(jīng)病理痛的機(jī)制，掌握了各種炎性痛、神經(jīng)病理痛模型的制備方法和研究思路，為進(jìn)行針刺鎮(zhèn)痛原理研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；2007年9月回國，在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系任副教授；2009年11月至今在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系任教授。主持或參與國家自然科學(xué)基金等省市級以上科研項(xiàng)目12 項(xiàng)， 指導(dǎo)研究生獲得湖北省優(yōu)秀碩士學(xué)位論文獎(jiǎng)3項(xiàng)。在國內(nèi)外重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表論文 30 余篇。獲得實(shí)用新型專利一項(xiàng)。

研究方向：疼痛的細(xì)胞與分子神經(jīng)生物學(xué)，針刺對疼痛調(diào)整的機(jī)制研究

原文檢索：

Inhibition of GABAergic Neurons anExcitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor .

doi: 10.3389/fnins.2019.00484

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本文由李熳教授撰稿，賽業(yè)生物授權(quán)編輯。