從本期起，小編將帶領(lǐng)大家使用殷賦云計(jì)算平臺(tái)（http://cloud.yinfotek.com/）來(lái)做一系列計(jì)算“文章”。這一期咱們來(lái)重現(xiàn)一篇2018年文獻(xiàn)[1]的計(jì)算結(jié)果，看看作者是如何運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)來(lái)闡明機(jī)理、升華文章的。該文獻(xiàn)影響因子4.6，是典型的“實(shí)驗(yàn)+計(jì)算”模式，比較接近大多數(shù)科研人員的研究現(xiàn)狀，只要熟悉這種模式，稍加努力即可發(fā)表同等水平的論文。

文獻(xiàn)作者通過(guò)細(xì)胞MTT試驗(yàn)從8000多個(gè)小分子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型的抗流感病毒化合物D715-2441。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，它對(duì)流感A病毒多種亞型（H1N1、H5N1、H7N9、H3N2、臨床分離株690（H3）和帶H274Y NA變異的奧司他韋抗性株）均有抗病毒活性，能夠抑制病毒復(fù)制的早期階段。更重要的是，D715-2441明顯抑制病毒聚合酶的活性，并且直接影響PB2蛋白的定位。結(jié)合親和力分析明確了該化合物特異性結(jié)合在PB2cap蛋白上。為了闡明抑制劑D715-2441的作用機(jī)理，文獻(xiàn)作者采用DOCK 6分子對(duì)接技術(shù)分析其結(jié)合模式。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，分子對(duì)接的計(jì)算步驟包括4步：

1、 準(zhǔn)備配體（小分子）和受體（生物大分子，比如蛋白）結(jié)構(gòu)；

2、 定義對(duì)接口袋；

3、 進(jìn)行對(duì)接計(jì)算；

4、 分析對(duì)接結(jié)果（打分與結(jié)合模式分析）。

下面，小編圖文并茂地教大家使用殷賦云計(jì)算平臺(tái)的DOCK6方案來(lái)完成對(duì)接計(jì)算與分析。本教程不打算詳盡地講解每一個(gè)操作步驟，僅將大體過(guò)程和關(guān)鍵要點(diǎn)講清楚。但講了很多值得注意的細(xì)節(jié)，這是一般教程上看不到的經(jīng)驗(yàn)之談。讀者如果對(duì)本平臺(tái)操作不是很熟悉，請(qǐng)翻看相應(yīng)教程（分子對(duì)接結(jié)合模式預(yù)測(cè)教程）。

 

分子對(duì)接計(jì)算需要準(zhǔn)備配體小分子和受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)。配體結(jié)構(gòu)通常小而簡(jiǎn)單，可用軟件構(gòu)建，但蛋白結(jié)構(gòu)大且復(fù)雜，通常采用實(shí)驗(yàn)解析的結(jié)構(gòu)，可從RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載。本工作用到的PB2cap蛋白PDB編號(hào)是4CB4，請(qǐng)自行登錄網(wǎng)址https://www.rcsb.org/structure/4CB4下載（4cb4.pdb文件）。

登錄平臺(tái)，創(chuàng)建項(xiàng)目，填寫(xiě)內(nèi)容。“簡(jiǎn)略備注”和“詳細(xì)描述”是給你自己看的，可不填，但填寫(xiě)備忘是個(gè)值得鼓勵(lì)的好習(xí)慣。然后，選擇計(jì)算方案或工具。在這里，我們選擇跟文獻(xiàn)同款的Dock6（結(jié)合模式預(yù)測(cè)）方案。之后，填寫(xiě)任務(wù)內(nèi)容。

平臺(tái)為準(zhǔn)備配體分子提供了多種輸入方式，最簡(jiǎn)單的莫過(guò)于在線畫(huà)結(jié)構(gòu)（繪制小分子）。在畫(huà)板上畫(huà)出D715-2441的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并填上分子名稱(chēng)（不要有中文、空格、特殊符號(hào)或除英文字母外的其他語(yǔ)言文字！）和點(diǎn)擊添加按鈕。

輸入的分子需要經(jīng)過(guò)處理才能用于對(duì)接，其中包括：添加氫原子、添加電荷、生成3D結(jié)構(gòu)和能量最小化。平臺(tái)已對(duì)大多數(shù)情況進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，因此，采用默認(rèn)設(shè)置即可。

值得注意的是：1、MMFF94力場(chǎng)是目前針對(duì)有機(jī)小分子最好的力場(chǎng)之一，也包括一些金屬元素[2]，但并非化學(xué)元素周期表全部元素都支持，必要時(shí)請(qǐng)使用UFF力場(chǎng)；2、電荷和能量?jī)?yōu)化使用的力場(chǎng)最好一致。

點(diǎn)擊準(zhǔn)備按鈕。

我們從視圖中看到經(jīng)過(guò)處理的配體結(jié)構(gòu)。盡管平臺(tái)已經(jīng)做得很好，但人工檢查仍是必要的。請(qǐng)根據(jù)你的化學(xué)知識(shí)，仔細(xì)檢查結(jié)構(gòu)是否正確，比如價(jià)鍵是否平衡、結(jié)構(gòu)是否無(wú)扭曲、構(gòu)型是否正確。確定無(wú)問(wèn)題后，點(diǎn)擊確定按鈕；否則，返回前面，重新畫(huà)結(jié)構(gòu)或采用其他輸入方式。

與配體不同，受體分子通常是生物大分子，無(wú)法通過(guò)手繪準(zhǔn)備。平臺(tái)提供了其他輸入方式。點(diǎn)擊上傳文件，選擇剛才下載的4cb4.pdb文件，然后按提示進(jìn)行下去。

通常來(lái)說(shuō)，從PDB庫(kù)下載的晶體結(jié)構(gòu)文件里邊包含了很多組分，不僅有（單條或多條）肽鏈，通常還有有機(jī)小分子和溶劑分子（水分子、金屬離子）。如果下載的是NMR結(jié)構(gòu)，還可能包含多個(gè)蛋白構(gòu)象（稱(chēng)為model）。

在準(zhǔn)備受體結(jié)構(gòu)這一步，我們需要定義選用哪個(gè)模型（默認(rèn)為1）、哪部分結(jié)構(gòu)歸為受體、哪部分為配體（將被提取出來(lái)用于口袋定位；若沒(méi)有，可不定義）和其他雜質(zhì)。在這里，我們選擇A:PROTEIN為受體，A:MGT1484為配體，沒(méi)有選上的部分將在后續(xù)處理中被程序刪除。

我們需要定義化合物D715-2441結(jié)合的大致區(qū)域——對(duì)接口袋。在上面的步驟中，我們提取了晶體結(jié)構(gòu)中原先就存在的配體分子。通過(guò)文獻(xiàn)了解到，它的結(jié)合位置就是D715-2441可能的結(jié)合區(qū)域。事實(shí)上，對(duì)該蛋白而言，也只有這里才靠譜。

通過(guò)選擇文件方式，從彈出的文件列表選擇MGT.pdb，點(diǎn)擊顯示盒子。稍等片刻，視圖中將出現(xiàn)一個(gè)綠色盒子將MGT分子包圍。我們需要保證的是，該盒子足夠大，能夠把口袋包圍住。默認(rèn)設(shè)置基本足夠，必要時(shí)可增大小球范圍（可能導(dǎo)致盒子擴(kuò)大）。然后點(diǎn)擊生成格點(diǎn)。這一步通常比較久，請(qǐng)耐心等待。然后，點(diǎn)擊確定按鈕。

Dock6方案為我們提供了多種對(duì)接計(jì)算模式，這里稍微解釋一下。

在各種模式中，蛋白受體都是剛性不動(dòng)的。因?yàn)镈ock6的Grid算法實(shí)際上并非直接采用蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，而是采用其模型（正是前面生成的格點(diǎn)）。根據(jù)配體運(yùn)動(dòng)的方式，分為下面幾種情況：

1） 柔性配體對(duì)接，即配體在對(duì)接過(guò)程中是柔性可變的，可旋轉(zhuǎn)單雙鍵產(chǎn)生不同構(gòu)象。這是最常用的默認(rèn)的模式；

2） 固定錨點(diǎn)對(duì)接，即在口袋中對(duì)配體進(jìn)行小范圍構(gòu)象搜索，配體有一塊結(jié)構(gòu)（通常為最大的剛性結(jié)構(gòu)）看似被固定住，而其他部分則可變動(dòng)。該模式的用處是，在保持配體整體結(jié)合位置不變的情況下，尋找更好的結(jié)合模式；

3） 剛性配體對(duì)接，即配體是剛性的，不能旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵，僅可整體平移和翻轉(zhuǎn)。可能的使用場(chǎng)景是，配體的構(gòu)象具有某種特殊意義，希望對(duì)接后保持不變，或者評(píng)估蛋白是否能夠容納這種構(gòu)象；

4） 原位優(yōu)化（in-situ minimization），即在口袋中對(duì)配體分子進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，不進(jìn)行構(gòu)象搜索。可用于優(yōu)化配體的結(jié)合模式；

5） 打分評(píng)價(jià)，即對(duì)口袋中的配體分子進(jìn)行打分評(píng)價(jià)，不進(jìn)行構(gòu)象搜索�？刹捎貌煌�打分函數(shù)對(duì)配體某一結(jié)合模式進(jìn)行重打分。

我們采用柔性配體對(duì)接模式，其他參數(shù)采用默認(rèn)值，然后提交任務(wù)。

Dock6方案的對(duì)接總打分是Grid Score，負(fù)值表示有結(jié)合，正值表示不結(jié)合，因此，打分值越�。ㄘ�(fù)值的絕對(duì)值越大）表示結(jié)合力越強(qiáng)。它與另外兩項(xiàng)能量項(xiàng)——范德華力和靜電力——的關(guān)系是：Grid Score = Grid_vdw + Grid_es。Internal Energy是分子內(nèi)能，表示對(duì)接構(gòu)象（pose）的張力大小，正值，越小越好，通常20 kcal/mol以下比較合理。Pose列是對(duì)接構(gòu)象編號(hào)，按照Grid Score從小到大排列。因此，第一個(gè)pose即為對(duì)接軟件根據(jù)打分判斷為最好的對(duì)接構(gòu)象。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，Grid Score>-40 kcal/mol屬于結(jié)合力較差，-40~-50kcal/mol屬于中等，<-50kcal/mol屬于較好。由于D715-2441分子較小，所以疏水作用面積小，范德華力貢獻(xiàn)自然較小，靜電力貢獻(xiàn)通常也不會(huì)很大，導(dǎo)致整體打分較差。這是可以理解的，也應(yīng)理解為該對(duì)接構(gòu)象還算合理。

從打分分布看，各個(gè)pose的打分相差不大，范德華力貢獻(xiàn)為主，第一個(gè)pose的靜電力貢獻(xiàn)相對(duì)其他pose出奇地大，意味著它具有較多較強(qiáng)的靜電作用力（比如氫鍵和鹽橋）。

仔細(xì)觀察各個(gè)pose，結(jié)合上面的對(duì)接打分。我們認(rèn)為第一個(gè)pose 的作用力最多，結(jié)合力最好，結(jié)合方式符合預(yù)期，是最好的構(gòu)象。對(duì)比文獻(xiàn)，這個(gè)pose與之幾乎完全一致（下面會(huì)解釋差異之處）。因此，我們選擇它來(lái)做結(jié)合模式分析。

為清晰起見(jiàn)，點(diǎn)擊視圖右側(cè)Protein下的cartoon按鈕，去掉cartoon樣式。點(diǎn)擊Ligand下的center按鈕，居中顯示配體。我們清晰地看到，化合物D715-2441的芳環(huán)結(jié)構(gòu)夾在H357的咪唑環(huán)和F404的苯環(huán)之間形成三明治結(jié)構(gòu)，并與之分別形成π-π堆積作用（黃線），還有與F404的疏水作用（灰線），這些作用力一起構(gòu)成了范德華力，提供了約-35.48kcal/mol的結(jié)合力貢獻(xiàn)。另一方面，E361的羧基和K376的質(zhì)子化N原子同時(shí)與苯環(huán)上的羥基形成氫鍵，氫鍵距離、角度可從下方表格查到。F404骨架上的氧原子也與D715-2441另一個(gè)羥基形成氫鍵作用。與文獻(xiàn)不同的是，K339的N+原子和H357的咪唑基都跟環(huán)酯基形成鹽橋作用。這種作用通常認(rèn)為是非典型的，所以文獻(xiàn)未提及，但在我們的檢測(cè)分析工具里，它被呈現(xiàn)出來(lái)。這些極性作用為化合物的結(jié)合提供了較強(qiáng)的靜電力貢獻(xiàn)（約-7.69kal/mol），這也是該pose相對(duì)其他pose而言靜電力非常顯著的原因。

跟文獻(xiàn)存在差異的另一個(gè)地方是，文獻(xiàn)顯示Phe323與化合物存在π-π堆積作用，Phe325存在疏水作用。但在我們的分析結(jié)果中，并沒(méi)有出現(xiàn)這兩個(gè)作用力。實(shí)際上，這兩個(gè)氨基酸殘基距離底物稍遠(yuǎn)，剛好超過(guò)該分析工具的相互作用力幾何判斷標(biāo)準(zhǔn)。但若將其原子結(jié)構(gòu)顯示出來(lái)，即發(fā)現(xiàn)也在附近（下圖）。在柔性配體對(duì)接模式下，蛋白是剛性的，蛋白口袋的形狀、殘基位置未必是與配體最契合的。普遍認(rèn)為，蛋白-配體之間存在“誘導(dǎo)契合”效應(yīng)。在真實(shí)情況下，由于分子熱運(yùn)動(dòng)，蛋白、配體間距離不可能一成不變。對(duì)接計(jì)算只是展示了其靜態(tài)的一面，在真實(shí)世界里，幾何距離在臨界點(diǎn)附近的作用力可能“若隱若現(xiàn)”。

高質(zhì)量的文章需要高質(zhì)量的Figure。小編將在下期教大家使用PyMOL做上乘的蛋白-配體結(jié)合模式圖。敬請(qǐng)關(guān)注~

[1] Teng et al. A Small-Molecule Compound Has Anti-influenza A Virus Activity by Acting as a “PB2 Inhibitor”. Mol. Pharmaceutics, 2018, 15 (9), pp 4110-4120. DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.8b00531

[2] https://open-babel.readthedocs.io/en/latest/Forcefields/mmff94.html#mmff94-force-field