NAT COMMUN | 衰老退化為哪般？蛋白質(zhì)組學(xué)（TMT+label-free）破譯衰老密碼
 

眾所周知，干細(xì)胞的老化被認(rèn)為是導(dǎo)致組織和器官老化的根本原因，尤其是在高周轉(zhuǎn)率的生物系統(tǒng)中，比如造血作用。隨著干細(xì)胞的老化，受損組織被替換的潛能也會(huì)隨之減弱，在人體中，貧血，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)能力的下降，以淋巴細(xì)胞為代價(jià)的骨髓細(xì)胞的擴(kuò)張，以及頻發(fā)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，這些都已經(jīng)被報(bào)道與衰老息息相關(guān)。但是這些變化的機(jī)制仍然難以捉摸。2018年新發(fā)表于NATURE COMMUNICATIONS上的來自歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們就關(guān)注該方向，這項(xiàng)研究的首要目的就是利用TMT和labelfree技術(shù)對(duì)人類hpc細(xì)胞以及骨髓壁龕中的細(xì)胞群老化過程進(jìn)行研究，從而揭秘衰老的分子機(jī)制。

文獻(xiàn)來源

https://www.onacademic.com/detail/journal_1000040868031610_5093.html   IF=12.353

研究材料

59例年齡在20到60歲之間的志愿者，對(duì)通過髂后嵴穿刺得到的細(xì)胞進(jìn)行分離，得到HPC細(xì)胞，和其它5種與骨髓壁龕相關(guān)的細(xì)胞：LYM（淋巴細(xì)胞和前體），MON（單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和前體），GRA（粒細(xì)胞前體），ERP（紅細(xì)胞前體），MSC（間充質(zhì)干細(xì)胞/wd基質(zhì)細(xì)胞）。

技術(shù)方法

TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組和label free分級(jí)非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)（如下圖）。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供了潛在分子機(jī)制的藍(lán)圖，并指出與年輕的HPCs相比，老化HPC中與細(xì)胞周期，骨髓譜系規(guī)范以及髓樣惡性腫瘤相關(guān)的基因上調(diào)�；�于TMT的定量方法，準(zhǔn)確測(cè)定同一細(xì)胞群內(nèi)衰老過程中的變化，而利用 label free(LF)的方法來評(píng)估不同細(xì)胞群之間的蛋白質(zhì)豐度。這也是本文的一個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)，利用2種定量組學(xué)來分別分析細(xì)胞群內(nèi)和細(xì)胞群之間的蛋白水平的變化。文章還結(jié)合Single-cellRNA-sequencing法對(duì)HPCs進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，檢測(cè)了蛋白組中顯著變化的蛋白的相關(guān)轉(zhuǎn)錄水平的變化。

結(jié)果分析

1. 鑒定到蛋白的結(jié)果展示

對(duì)分離得到的6種細(xì)胞分別進(jìn)行l(wèi)abel free和TMT定量分析，總共鑒定到12158中蛋白，并展示了6種細(xì)胞的鑒定數(shù)量及其之間的重疊性。

2. 對(duì)label free得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)合斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，得到結(jié)果如下圖b，可以看出常見表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)能夠用區(qū)分6個(gè)不同的細(xì)胞群，這可能反映了不同的細(xì)胞系對(duì)譜系定向的特定代謝需求以及對(duì)細(xì)胞特定過程和功能的適應(yīng)。為了了解不同細(xì)胞群中通路的豐度是否不同，作者對(duì)LF數(shù)據(jù)基于Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了通路分析，下圖C是通路結(jié)果的展示，通過數(shù)據(jù)整合分析發(fā)現(xiàn)一些主要的蛋白都涉及了糖酵解通路。

3. 年齡對(duì)蛋白組的影響

為了研究年齡增加與蛋白組變化之間的關(guān)系，作者對(duì)TMT數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman's相關(guān)性分析，并基于Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析，這一分析揭示了蛋白質(zhì)豐度中細(xì)胞類型特異性和年齡相關(guān)性的顯著變化，如上圖a顯示了基于每個(gè)細(xì)胞群體中五個(gè)最高上調(diào)和下調(diào)的途徑所篩選到的109個(gè)通路。作者還找到了一些已報(bào)道的老化標(biāo)志物的變化，比如說，在老化的HPC細(xì)胞中，IRF8和DNMT1這兩個(gè)都會(huì)減少。

4. 在HPC細(xì)胞中年齡影響碳代謝

通過分析，作者發(fā)現(xiàn)年齡引起的HPC細(xì)胞最值得關(guān)注的變化就是酶的變化，這些酶在在糖酵解，糖原分解代謝，以及脂肪酸β氧化中扮演很重要的角色。中心碳循環(huán)在衰老中發(fā)生了顯著變化，圖a描述了HCP細(xì)胞的葡萄糖代謝和TCA循環(huán)，箭頭代表但單向反應(yīng)，筆畫代表雙向反應(yīng)，不同的顏色代表不同的表達(dá)情況，黑色代表該酶不隨年齡變化，紅色和藍(lán)色分別代表顯著上調(diào)和下調(diào)的酶。最終發(fā)現(xiàn)有17種蛋白在糖酵解和TCA循環(huán)通路中發(fā)生了顯著的變化（可以考慮深入研究一下代謝組學(xué)數(shù)據(jù)）。

5. 衰老時(shí)髓樣與淋巴分化的比較

另外，作者還發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，骨髓細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的分化程度更高。在HPC群中明確發(fā)現(xiàn)的17種蛋白，它們參與維持多能性，或者沿著髓系或淋巴系分化。為了描述HPCs與年齡相關(guān)的功能衰減，作者隨后檢測(cè)了這些蛋白的豐度隨年齡的變化動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)與淋巴樣發(fā)育和功能直接相關(guān)的2個(gè)蛋白（DNTT and BCL11A）隨著HPCs老化顯著減少，相反的，下游信號(hào)效應(yīng)物GUCY1A3and GUCY1B3，隨著HPCs老化顯著增加，一氧化氮——環(huán)鳥苷酸通路信號(hào)傳導(dǎo)已被證明可以調(diào)節(jié)造血作用，也可能表明分化傾向于髓系。

為了檢查糖酵解途徑的準(zhǔn)備階段中酶豐度的增加是否可能是CD34 +細(xì)胞譜系偏向骨髓分化的直接后果，作者分析了自年輕人（n = 2）和老人（n = 2）受試者的519個(gè)單細(xì)胞分選的HPCs的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果�；�于淋巴或髓樣分化的信使RNA（mRNA）標(biāo)記的豐度水平，對(duì)每個(gè)單獨(dú)的HPC細(xì)胞進(jìn)行分類（圖c）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨髓引發(fā)的HPCs中年齡增加的糖酵解酶的mRNA水平高于淋巴引發(fā)的，而未受年齡影響的酶的轉(zhuǎn)錄物在兩個(gè)子集中保持相似的水平。

6. 與HPCs有關(guān)的骨髓壁龕的變化

由細(xì)胞微環(huán)境產(chǎn)生的幾個(gè)負(fù)責(zé)HPCs的歸巢和外出必要因子和粘附分子，在MSCs老化時(shí)豐度都有所下降，而基質(zhì)細(xì)胞衍生因子- 1（SDF-1/CXCL12），血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM1）以及纖連蛋白（FN1）在MSCs老化時(shí)豐度都發(fā)生了增強(qiáng)。這些變化表明，衰老與ECM的重組以及骨髓壁龕架構(gòu)的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

小結(jié)

這篇文章主要是通過經(jīng)典的TMT和label-free的高通量組學(xué)，結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序研究衰老過程中HPC細(xì)胞群分化與功能衰退以及對(duì)骨髓分化的偏向，且深入分析了不同的年齡表型與功能表現(xiàn)差異，從而揭示出衰老引起骨髓壁龕的變化，同時(shí)會(huì)引起HPC歸巢涉及通路的功能的衰退，為探索衰老機(jī)制提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)，也會(huì)后期的研究提供了研究思路和方向。

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