敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)在中草藥研究中的應(yīng)用
中國微生物菌種查詢網(wǎng)  敞開式離子化質(zhì)譜(ambient ionization mass spectrometry，AIMS)是近年來興起的一種無需(或稍許)樣品前處理步驟，在敞開的大氣環(huán)境下實現(xiàn)離子化的質(zhì)譜分析技術(shù)。近年來，各種AIMS技術(shù)的研制與應(yīng)用成為質(zhì)譜領(lǐng)域備受關(guān)注的焦點之一。本工作綜述了AIMS技術(shù)在中草藥研究中的應(yīng)用，對典型的分析策略進(jìn)行了討論，闡述了AIMS技術(shù)的基本原理、特點和分類，并展望了該技術(shù)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域未來發(fā)展的趨勢和可能的影響.

 敞開式離子化質(zhì)譜(ambient ionization mass spectrometry，AIMS)是一種能在敞開的常壓環(huán)境下直接對樣品或樣品表面物質(zhì)進(jìn)行分析的新型質(zhì)譜技術(shù)，此技術(shù)無需(或者只需簡單的)樣品前處理，便可實現(xiàn)對樣品的分析，具有實時、原位、高通量、簡便快速、環(huán)保、可以與各種質(zhì)譜儀器聯(lián)用等一系列優(yōu)點，同時兼具傳統(tǒng)質(zhì)譜的高分析速度、高靈敏度等特點。2004年Cooks課題組在電噴霧電離基礎(chǔ)上首次提出解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization，DESI)技術(shù)。2005年Cody等在大氣壓化學(xué)電離基礎(chǔ)上研制出實時直接檢測的DART(Direct analysis in real time)技術(shù);幾乎同時，謝建臺等也研制出類似的電噴霧輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)。繼而，AIMS的研發(fā)引起了廣泛關(guān)注，各類新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，目前AIMS技術(shù)的種類已有40余種。為促進(jìn)AIMS技術(shù)的創(chuàng)新和發(fā)展，由中國質(zhì)譜學(xué)會和華質(zhì)泰科生物技術(shù)(北京)有限公司共同主辦的AIMS國際學(xué)術(shù)年會從2013年至今已經(jīng)成功舉辦4次，引領(lǐng)著AIMS技術(shù)迅速向各個行業(yè)逐層滲透，深深地影響著下一代分析檢測技術(shù)的開發(fā)和利用。與經(jīng)典的電噴霧、大氣壓化學(xué)電離和大氣壓光電離等電離方式相比，AIMS具有溶劑消耗少、更強(qiáng)的耐鹽和抗基質(zhì)干擾能力，同時，AIMS的敞開結(jié)構(gòu)和模塊化設(shè)計使其可以方便的與各種質(zhì)譜連接，從而大大降低了儀器購置成本。這一技術(shù)在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品安全、環(huán)境污染物監(jiān)控、爆炸物檢測、生物分子及代謝物表征、分子成像等諸多領(lǐng)域已展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。因此，AIMS的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究備受質(zhì)譜學(xué)家的關(guān)注，基礎(chǔ)研究主要圍繞構(gòu)建開發(fā)新型的AIMS離子源，探究研究相應(yīng)的離子化機(jī)理;應(yīng)用研究主要是對各種實際樣品進(jìn)行定性和定量分析。本工作著重綜述AIMS在中草藥研究中的應(yīng)用，通過對典型的分析策略進(jìn)行討論，闡述AIMS技術(shù)的基本原理、特點和分類，并展望該技術(shù)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域未來發(fā)展的可能趨勢和影響。
 
⒈敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)的基本原理、特點和分類
AIMS集成了樣品原位解吸附、待測物實時離子化和離子傳輸至質(zhì)量分析器三個核心步驟。下面，以DART為例，介紹離子化的基本原理：利用He或者N2作為工作氣通過放電室，放電室內(nèi)部的陰極和陽極之間施加一個高達(dá)幾千伏的電壓導(dǎo)致高壓輝光放電，使工作氣電離成為含激發(fā)態(tài)氣體原子或分子、離子、電子的等離子體氣流。等離子體氣流流經(jīng)圓盤電極，選擇性地移除某些離子后被加熱，加熱等離子體氣流從DART口噴出至樣品表面，完成熱輔助的解吸附和離子化過程。離子化機(jī)理一般認(rèn)為包括周圍氣體被激發(fā)態(tài)工作氣體的彭寧(Penning)電離、進(jìn)而發(fā)生的質(zhì)子轉(zhuǎn)移以及其他類型氣相離子分子反應(yīng)等過程。AIMS技術(shù)不僅可在常壓下對待測樣品離子化，而且離子源的敞開結(jié)構(gòu)易于實現(xiàn)物體表面的直接離子化及質(zhì)譜分析。這類離子源操作簡便、快捷，無需復(fù)雜的樣品前處理。AIMS技術(shù)的另一重要特征是快速及高通量，通常每個樣品的分析時間不超過5s，充分展現(xiàn)了質(zhì)譜快速分析的優(yōu)勢，為高通量分析提供了一種新的有效途徑。因此，常壓敞開式離子源開辟了質(zhì)譜技術(shù)在無需樣品前處理的直接、快速分析，表面與原位分析等領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用領(lǐng)域。
 
AIMS離子源按照其離子化過程和機(jī)理可以分為三大類：1)直接電離離子源。樣品直接進(jìn)入高電場被電離，如，在ESI源基礎(chǔ)上發(fā)展起來的眾多離子源，包括直接電噴霧探針(Direct electrospray probe ionization，DEPI)、探針電噴霧電離(Probe electrospray ionization，PESI)、紙噴霧電離(Paper spray ionization，PSI)、場致液滴電離(Field induced droplet ionization，F(xiàn)IDI)和超聲波電離(Ultra-sound ionization，USI)等;2)直接解吸電離離子源，同時起到對樣品解吸和電離的作用。包括解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization，DESI)、電場輔助解吸電噴霧電離(Electrode-assisted desorption electrospray ionization，EADESI)、簡易敞開式聲波噴霧電離(Easy ambient sonic spray ionization，EASI)、解吸大氣壓化學(xué)電離(Desorption atmospheric pressure chemical ionization，DAPCI)、介質(zhì)阻擋放電電離(Dielectric barrier discharge ionization，DBDI)、等離子體輔助解吸電離(Plasma-assisted desorption ionization,PADI)、大氣壓輝光放電電離(Atmospheric glow discharge ionization,APGDI)、解吸電暈束電離(Desorption corona beam ionization,DCBI)、激光噴霧電離(Laser spray ionization,LSI)等;3)解吸后電離離子源。這是一種兩步機(jī)理離子源,第1步先對被分析物進(jìn)行解吸附,第2步實現(xiàn)被分析物的電離過程,包括氣相色譜-電噴霧質(zhì)譜(Gas chromatography electrospray ionization,GC-ESI)、二次電噴霧電離(Secondary electrospray ionization,SESI)、熔融液滴電噴霧電離(Fused droplet electrospray ionization,FD-ESI)、萃取電噴霧電離(Extractive electrospray ionization,EESI)、液體表面彭寧電離質(zhì)譜(Liquidsurface Penning ionization,LPI)、大氣壓彭寧電離(Atmospheric pressure Penning ionization,APPeI)、電噴霧激光解吸電離(Electrospray laser desorption ionization,ELDI)、基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離(Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization,MALDESI)、激光消融電噴霧電離(Laser ablation electrospray ionization,LAESI)、紅外激光輔助解吸電噴霧電離(Infrared laser-assisted desorption electrospray ionization,IR-LADESI)、激光電噴霧電離(Laser electrospray ionization,LESI)、激光解吸噴霧后離子化(Laser desorption spray post-ionization,LDSPI)、激光誘導(dǎo)聲波解吸電噴霧電離(Laser-induced acoustic desorption electrospray ionization,LIAD-ESI)、激光解吸-大氣壓化學(xué)電離(Laser desorption-atmospheric pressure chemical ionization,LD-APCI)、激光二極管熱解吸電離(Laser diode thermal desorption,LDTD)、電噴霧輔助熱解吸電離(Electrospray-assisted pyrolysis ionization,ESA-Py)、大氣壓熱解吸-電噴霧電離(Atmospheric pressure thermal desorption-electrospray ionization,AP-TD/ESI)、基于熱解吸敞開式電離(Thermal desorption-based ambient ionization,TDAI)、大氣壓固態(tài)分析探針(Atmosphericpressure solids analysis probe,ASAP)、實時直接分析(Direct analysis in real time,DART)、解吸大氣壓光致電離(Desorption atmospheric pressure photoionization,DAPPI)等。
 
⒉敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)在中草藥研究中的應(yīng)用
建立一種新的方法,能夠?qū)χ胁菟幹械乃幮С煞趾碗s質(zhì)進(jìn)行分析,這對于中草藥的質(zhì)量評價和質(zhì)量控制有重要意義。敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為中草藥分析提供了一種快速、直接的手段。本文綜述了不同類型敞開式離子化質(zhì)譜在中草藥分析中的應(yīng)用,并對典型分析案例加以討論。
⑴直接電離離子源
直接電離離子源是基于電噴霧原理的直接電離敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù),將樣品組織中分析物直接電離進(jìn)行質(zhì)譜分析。這項技術(shù)快速、直接、實時、原位,無需樣品前處理,適用于中藥材直接分析。主要應(yīng)用技術(shù)包括：直接電離(Direct ionization)、組織噴霧電離(Tissue spray)、葉片噴霧(Leaf spray)、直接植物噴霧(Direct plant spray)場致直接電離(Field-induced DI)、內(nèi)部萃取電噴霧電離(Internal extractive electrospray ionization mass spectrometry,iEESI)等。雖然這些技術(shù)的名稱不同,但它們的原理和分析策略是相似的,即,將樣品本身作為固體基質(zhì),應(yīng)用溶劑和高電壓使分析物溶解或萃取到溶劑中,液相分析物分子在高電場作用下直接電離、噴霧、產(chǎn)生帶電液滴和離子進(jìn)行質(zhì)譜分析。
姚鐘平課題組在固體基質(zhì)下的電噴霧離子化機(jī)理與應(yīng)用方面做了大量的研究工作。固體基質(zhì)電噴霧電離是將中草藥的粉末、混懸液、提取液附著于固體基質(zhì)上用于直接電離分析,可用的固體基質(zhì)包括：純金屬探針、紙三角、木片、鋁箔、移液器頭等。因鋁箔具有惰性、不滲透性、相對剛性等特點,可以折疊承載溶劑,對粉末樣品有目的性的提取,在敞開式的環(huán)境下進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析。鋁箔電噴霧質(zhì)譜已經(jīng)成功應(yīng)用于西洋參和附子等中藥粉末樣品中主要成分的測定。移液器頭模式的分析是將移液器頭與質(zhì)譜進(jìn)樣器和進(jìn)樣泵連接,在線提取進(jìn)樣器頭中的中藥粉末,加以高電壓使帶電有機(jī)溶劑通過中藥粉末將分析物提取出來后電離,經(jīng)由質(zhì)譜分析。這種移液器頭模式的分析已成功應(yīng)用于人參、西洋參和三七中皂苷類成分、南、北五味子中木脂素類成分和多種藥材中生物堿類成分的測定。
⑵直接解吸電離離子源
自DESI問世以來，其在中草藥分析中的應(yīng)用已被陸續(xù)報道。采用的主要方式包括：分析物的表面解吸電離、反應(yīng)直接解吸電離、分析物的表面成像、薄層色譜與直接解吸電離質(zhì)譜聯(lián)用等，其中應(yīng)用最廣泛的是分析物的表面解吸電離，無需中藥材樣品的前處理，可直接分析。
DAPCI是應(yīng)用大氣壓電暈放電從化學(xué)試劑中產(chǎn)生電子、質(zhì)子、亞穩(wěn)態(tài)原子、水合氫離子和質(zhì)子化溶劑離子，去解吸電離樣品表面的分析物，進(jìn)行質(zhì)譜分析，主要用于分析低分子質(zhì)量的揮發(fā)性或半揮發(fā)性化合物。已報道的研究有南、北五味子中萜品烯類成分和人參、紅參中皂苷類成分的分析。
DCBI是將高直流電壓加在尖針上引發(fā)氦原子電暈放電，在電暈針附近產(chǎn)生激發(fā)態(tài)離子，與分析物在樣品表面發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生單電荷分析物離子，進(jìn)行質(zhì)譜分析。應(yīng)用DCBI分析中草藥中低極性成分是極具挑戰(zhàn)性的。為了解決這一難點，文獻(xiàn)報道了一種設(shè)計方案，將反應(yīng)試劑(飽和氫氧化鈉與甲醇溶液，3:7，V/V)加入樣品中以提高DCBI的電離效率，并將該方法成功應(yīng)用于6種中藥材中生物堿的測定，并將其與TLC聯(lián)用測定生物堿的含量。
⑶解吸后電離離子源
DART-MS是在中草藥分析中應(yīng)用較為廣泛的一種敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)，其離子源目前已有商品化的產(chǎn)品。DART-MS的主要分析策略包括：分析物的表面解吸電離，將樣品置于DART源與質(zhì)譜進(jìn)口;粉末樣品的分析，將填充樣品的玻璃毛細(xì)管(棒)置于DART源加熱的氣體束中電離;液態(tài)樣品分析，將樣品滴在熔點管(浸管)、金屬篩網(wǎng)(不銹鋼金屬網(wǎng)格)上面，置于DART源與質(zhì)譜進(jìn)口之間;TLC與DART-MS聯(lián)用分析，是將化合物在薄層板上分離后，將薄層板置于DART源與質(zhì)譜進(jìn)口之間，分析物經(jīng)加熱氣體的熱解吸附，通過離子-分子反應(yīng)使分析物電離再引入質(zhì)譜進(jìn)行分析。
EESI和nano-EESI是基于電噴霧電離的敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)明最初主要被應(yīng)用于液態(tài)和氣態(tài)樣品分析，被分析物從溶液相或氣相樣品中被萃取出來，經(jīng)由電噴霧電離產(chǎn)生離子進(jìn)行質(zhì)譜分析。陳煥文課題組將Nano-EESI-MS技術(shù)成功應(yīng)用于人參中人參皂苷的測定。將激光解吸或消融與電噴霧結(jié)合的敞開式離子化技術(shù)(LAESI)適用于固體樣品分析，在中草藥分析中的應(yīng)用主要有：孔雀草根、莖、葉中的成分分析和鼠尾草葉中萜類成分的測定。將敞開式離子化技術(shù)與光致電離原理相結(jié)合，應(yīng)用于中草藥研究中，主要有兩種方式：解吸大氣壓化學(xué)電離(DAPPI)和激光消融大氣壓光致電離(LAAPPI)。這兩種方式可以使樣品表面非極性和中性分析物有效電離進(jìn)行質(zhì)譜分析，另外，這兩種方式還具有表面成像功能，例如，DAPPI-MS和LAAPPI-MS技術(shù)在鼠尾草葉成分表面成像研究中的應(yīng)用，以及枳殼葉中主要藥效成分的DAPPI-MS分析等。等離子體輔助激光解吸質(zhì)譜(PALDI-MS)已被成功用來研究黃芩中黃芩素和漢黃芩素成像，結(jié)果顯示，此成分集中分布于根的表皮維管束邊緣。
⑷在中草藥質(zhì)量評價和質(zhì)量控制中的應(yīng)用
隨著敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，其在中草藥質(zhì)量快速評價和控制中的應(yīng)用日益廣泛。敞開式離子化質(zhì)譜指紋分析方法能夠給出中草藥成分的整體化學(xué)輪廓，可用于評價中草藥質(zhì)量的穩(wěn)定性、追溯基源、鑒別真?zhèn)�。�?yīng)用敞開式離子化質(zhì)譜方法評價和控制中草藥質(zhì)量，首先要選擇一種適合的敞開式離子化技術(shù)，建立指紋圖譜分析方法，進(jìn)而對樣品進(jìn)行分析，將獲得的數(shù)據(jù)采用多變量統(tǒng)計分析方法處理，例如主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、聚類分析(HCA)等。
目前，應(yīng)用DART-MS技術(shù)結(jié)合多種統(tǒng)計分析方法，成功區(qū)分了蔞葉的不同栽培品種;區(qū)分了曼陀羅、蘿芙木、蓽澄茄以及傘形科中藥的不同品種，并鑒定了其中標(biāo)志性化學(xué)成分;區(qū)分了不同來源的當(dāng)歸;鑒定了川烏中標(biāo)志性化學(xué)成分，并區(qū)分了其炮制程度的不同。將DAPCI-MS技術(shù)結(jié)合PCA分析應(yīng)用于南、北五味子研究，成功區(qū)分了不同栽培品種和野生品種，并區(qū)分了不同炮制品種。應(yīng)用Wooden-tipESI-MS結(jié)合PCA和PLS-DA技術(shù)，鑒定了川貝母粉末的品種，并區(qū)分了其中摻偽品。
⑸本實驗室的研究工作
中藥成分的確認(rèn)和定量分析是近年來AIMS的重要發(fā)展方向之一，本實驗室選用商品化的DART為離子源，開發(fā)的方法具有較強(qiáng)的可重復(fù)性和實際應(yīng)用價值。研究內(nèi)容主要包括5個方面。
①中藥的快速分析：研究了8種中藥的化學(xué)成分，實現(xiàn)了生物堿類、黃酮類和部分人參皂苷的快速、直接分析;并對DART的電離機(jī)制進(jìn)行了較深入的討論;
②中藥成分的DART定量分析：針對中藥延胡索的功效成分延胡索甲素和乙素進(jìn)行DART定量分析，利用甲基化衍生和氘代內(nèi)標(biāo)實現(xiàn)了人參皂苷的DART定量分析;
③對DART技術(shù)不易電離成分的分析：本實驗室首次采用瞬時衍生化試劑四甲基氫氧化銨對皂苷和寡糖類成分進(jìn)行DART源內(nèi)的瞬時甲基化，通過甲基化衍生增加皂苷成分的揮發(fā)性，生成銨加合物離子，實現(xiàn)了多羥基化合物(如人參皂苷和寡糖)的DART分析檢測。其中，四甲基氫氧化銨不僅發(fā)揮了衍生化的作用，同時還作為輔助電離試劑增強(qiáng)了皂苷成分在DART中的靈敏度[62]。因為該反應(yīng)屬于自由基反應(yīng)，反應(yīng)控制難度較大，重復(fù)性還有待提高;
④DART用于農(nóng)藥殘留的檢測：針對100余種農(nóng)殘成分開展了DART快速檢測研究，發(fā)現(xiàn)多種農(nóng)藥成分在DART電離過程中不僅有加合離子(離子-分子反應(yīng)產(chǎn)物)，還產(chǎn)生碎片(過剩能量產(chǎn)生)，此外，實驗發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥會發(fā)生氧硫交換的氧化反應(yīng)，并對其反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了深入探討;
⑤開展DART電離機(jī)理研究：研究發(fā)現(xiàn)，不同的工作氣體(氦氣、氬氣、氮氣等)因其不同的電離能和氮氣的振動自由度影響，使得其在電離過程中展現(xiàn)出不同的特性，雖然氦氣因具有更高的電離能應(yīng)用范圍更廣，但是在某些場合下使用電離能較低的氬氣和氮氣(較氦氣價格低廉)產(chǎn)生的待測化合物碎片較少，再適當(dāng)引入輔助(make up)試劑可有效地提高待測物的靈敏度。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，具有較低電離能的氟苯和丙酮等作為輔助試劑能明顯的提高待測物的分析靈敏度。
 
⒊總結(jié)與展望
中藥品質(zhì)的安全有效主要取決于其中所含的藥效成分和雜質(zhì)，這就要求應(yīng)用快速、可靠的分析方法來評價和控制中藥材的質(zhì)量。目前，多種敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)已成功應(yīng)用于多種中藥中多種類型化學(xué)成分的檢測，并可對多種中藥的品質(zhì)進(jìn)行綜合評價和質(zhì)量控制。一般來講，對于揮發(fā)性較好或質(zhì)子親合能較高的成分，如生物堿，黃酮類等成分，電離可以直接發(fā)生在植物組織表面附近而不需借助溶劑和其他基質(zhì)。為了得到好的分析結(jié)果，對于皂苷類等組分需溶劑輔助，對于糖類組分的分析甚至需要簡單的衍生化。敞開離子化源，其原理之一是被分析物周圍的氣相離子-分子反應(yīng)，這些反應(yīng)很難達(dá)到經(jīng)典的密閉CI源平衡條件，因此，在實驗條件控制，數(shù)據(jù)的重復(fù)性方面還存在一些困難，尚需技術(shù)本身不斷完善。另外，對分析物的準(zhǔn)確定量方法也有待開發(fā)及改進(jìn)。以上這些問題需要分析化學(xué)家和質(zhì)譜學(xué)家的持續(xù)關(guān)注和潛心研究，相信在不遠(yuǎn)的將來，敞開式離子化技術(shù)與小型質(zhì)譜儀器結(jié)合的分析方法能應(yīng)用于中藥生產(chǎn)的田間地頭、成品藥生產(chǎn)線、中醫(yī)診斷的輔助等更多的中醫(yī)藥領(lǐng)域，為推動傳統(tǒng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代發(fā)展發(fā)揮更大的作用。