蛋白磷酸化水平的變化可指針疾病的變化，但卻鮮有磷酸化蛋白被開發(fā)成為疾病診斷標(biāo)記物。細(xì)胞外囊泡是由膜封閉的微環(huán)境，不受外界蛋白酶和其他酶的影響。這使得細(xì)胞外囊泡在體液中高度穩(wěn)定，為開發(fā)磷酸化蛋白應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷提供了契機(jī)。

今天為大家介紹一篇細(xì)胞外囊泡中磷酸化蛋白相關(guān)的文章：

Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer

​PNAS , doi: 10.1073/pnas.1618088114

本篇研究從微泡和外泌體中提取和鑒定到迄今為止數(shù)目最多的磷酸化蛋白，并對健康組和疾病組（乳腺癌）的磷酸化蛋白進(jìn)行相對定量分析。篩選出了多個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，并從中挑選了幾個(gè)靶點(diǎn)蛋白，用PRM的方法在健康組和疾病組中進(jìn)行了后期驗(yàn)證。

【主要結(jié)果】

1. 迄今為止最多，沒有之一

本實(shí)驗(yàn)中共鑒定到9643個(gè)磷酸化特征肽段，是迄今為止在人血樣來源的細(xì)胞外囊泡中鑒定到數(shù)目最多的磷酸化肽段。實(shí)驗(yàn)流程示意圖如下。

圖1. 實(shí)驗(yàn)流程示意圖（健康組n=6,疾病組n=18）

2. 微泡、外泌體大不同

平均1mL人血漿中可鑒定到7000條磷酸化特征肽段。在外泌體中鑒定到的磷酸化肽段，其中50%在微泡中也可被檢測到。這些磷酸化蛋白主要參與細(xì)胞通訊、刺激響應(yīng)和生物起源等生物學(xué)過程。微泡中酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸磷酸化所占比例分別為2.0%、14.1%、83.9%。而外泌體中酪氨酸磷酸化的比例則較高，為13.7%。與蘇氨酸的磷酸化比例（16.1%）接近。這表明微泡和外泌體的生物起源有很大差異。如圖2所示。

圖2. 微泡和外泌體中磷酸化肽段及磷酸化蛋白的分布

3. 不關(guān)蛋白組表達(dá)量的事，磷酸化水平確實(shí)升高了！

健康組與患病組細(xì)胞外囊泡蛋白組表達(dá)近乎一致的情況下，蛋白磷酸化水平卻表現(xiàn)出了顯著差異。表明這種差異不是由蛋白表達(dá)量的變化引起的，而切實(shí)反映了病患組細(xì)胞外囊泡蛋白磷酸化的程度（圖3）。

圖3. 微泡和外泌體蛋白組與磷酸化蛋白組的交疊維恩圖

4. PRM驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)-完整而嚴(yán)謹(jǐn)

挑選了四種磷酸化蛋白RALGAPA2、PKG1、TJP2和NFX1用PRM方法，在13個(gè)癌癥患者和7個(gè)健康樣本中進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明這四種蛋白在癌癥患者中顯著高表達(dá)。

【小編心得】

這是一篇采用Label-free相對定量及PRM靶向驗(yàn)證的方法，對乳腺癌患者細(xì)胞外囊泡進(jìn)行磷酸化蛋白進(jìn)行細(xì)致而完整的分析的一篇經(jīng)典文獻(xiàn)。不僅建立了細(xì)胞外囊泡磷酸化蛋白組研究的方法，實(shí)驗(yàn)中篩選到的磷酸化蛋白可望應(yīng)用于癌癥的診斷和篩查中，為診斷醫(yī)學(xué)起到巨大的推動作用。

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