多肽是由多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成的一類化合物，普遍存在于生物體內(nèi)，迄今在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多肽已達(dá)數(shù)萬(wàn)種。多肽在調(diào)節(jié)機(jī)體各系統(tǒng)、器官、組織和細(xì)胞的功能活動(dòng)以及在生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，并且常被應(yīng)用于功能分析、抗體研究、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。隨著生物技術(shù)與多肽合成技術(shù)的日臻成熟，越來(lái)越多的多肽藥物被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床。
多肽修飾種類繁多，可以簡(jiǎn)單劃分為后修飾和過(guò)程修飾（利用衍生化的氨基酸修飾），從修飾位點(diǎn)不同則可分為N端修飾、C端修飾、側(cè)鏈修飾、氨基酸修飾、骨架修飾等（圖1）。作為一種改變肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團(tuán)的重要手段，多肽修飾可有效改變肽類化合物的理化性質(zhì)、增加水溶性、延長(zhǎng)體內(nèi)作用時(shí)間、改變其生物分布狀況、消除免疫原性、降低毒副作用等。本文主要介紹幾種最主要的多肽修飾策略及特點(diǎn)。 環(huán)肽在生物醫(yī)學(xué)中具有諸多應(yīng)用，而且許多具有生物活性的天然多肽都是環(huán)狀多肽。由于環(huán)肽往往比線性肽更具有剛性，因此它們對(duì)消化系統(tǒng)具有極強(qiáng)的抵抗力，可以在消化道中存活，并且對(duì)靶受體表現(xiàn)出更強(qiáng)的親和力。環(huán)化是合成環(huán)狀多肽最直接的途徑，尤其對(duì)于結(jié)構(gòu)骨架較大的多肽。根據(jù)環(huán)化方式可以分為側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)�、終端-側(cè)鏈?zhǔn)健⒔K端-終端式（頭尾相連式）。 （1）側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)剑╯idechain-to-sidechain）
側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化最常見(jiàn)類型是半胱氨酸殘基間的二硫橋接，引入這種環(huán)化的方法是通過(guò)一對(duì)半胱氨酸殘基脫保護(hù)然后氧化構(gòu)成二硫鍵。通過(guò)選擇性地移除巰基保護(hù)基可以實(shí)現(xiàn)多環(huán)的合成。環(huán)化既可以在解離后的溶劑里完成，也可以在解離前的樹(shù)脂上完成。由于樹(shù)脂上的多肽不易形成可環(huán)化的構(gòu)象，因此在樹(shù)脂上環(huán)化可能要比在溶劑中環(huán)化低效。側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化的另一種類型是在門冬氨酸或谷氨酸殘基與基礎(chǔ)氨基酸之間形成酰胺結(jié)構(gòu)，它要求多肽無(wú)論是在樹(shù)脂上還是解離后，側(cè)鏈保護(hù)基都必須能夠選擇性移除。第三種側(cè)鏈-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化是通過(guò)酪氨酸或?qū)αu基苯甘氨酸形成聯(lián)苯醚。天然產(chǎn)物中這種類型的環(huán)化只在微生物產(chǎn)物中存在，而且環(huán)化產(chǎn)物往往具有潛在藥物價(jià)值。制備這些化合物需要獨(dú)特的反應(yīng)條件，因此不常用于常規(guī)多肽的合成。
（2）終端-側(cè)鏈?zhǔn)剑╰erminal-to-sidechain）
終端-側(cè)鏈?zhǔn)江h(huán)化通常涉及C末端與賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸側(cè)鏈的氨基，或者N末端與門冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈。還有一些多肽環(huán)化是通過(guò)末端C與絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈形成醚鍵而構(gòu)成。
（3）終端-終端式或頭尾相連式（head-to-tail）
鏈狀多肽可以在溶劑中環(huán)化或者固定在樹(shù)脂上通過(guò)側(cè)鏈環(huán)化。在溶劑中環(huán)化應(yīng)該用低濃度的多肽以避免多肽的低聚反應(yīng)。頭尾相連式合成環(huán)狀多肽的產(chǎn)率取決于鏈狀多肽的序列。因此，在大規(guī)模制備環(huán)狀多肽前，首先應(yīng)該創(chuàng)建可能的鏈狀先導(dǎo)多肽庫(kù)，然后進(jìn)行環(huán)化以尋找能達(dá)到最佳結(jié)果的序列。
2、N-甲基化
N-甲基化最初出現(xiàn)在天然多肽中，并被引入到多肽合成中以阻止氫鍵的形成，進(jìn)而使得多肽更加耐受生物降解和清除。利用N-甲基化的氨基酸衍生物合成多肽是最主要的方法，另外也可利用N-(2-硝基苯磺酰氯)多肽-樹(shù)脂中間體與甲醇進(jìn)行Mitsunobu反應(yīng)，該方法已被用于制備含有N-甲基化氨基酸的環(huán)狀多肽庫(kù)。
3、磷酸化
磷酸化是自然界中最常見(jiàn)的翻譯后修飾之一。在人類細(xì)胞中，超過(guò)30％的蛋白質(zhì)被磷酸化。磷酸化，尤其是可逆磷酸化，在控制許多細(xì)胞過(guò)程中起重要作用，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)以及細(xì)胞凋亡。
磷酸化可以在各種氨基酸殘基上觀察到，但最常見(jiàn)的磷酸化目標(biāo)是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基[4]。磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸衍生物既可在合成中引入到多肽也可在多肽合成以后形成。使用可選擇性移除保護(hù)基團(tuán)的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基可以實(shí)現(xiàn)選擇性磷酸化。一些磷�；�試劑也可通過(guò)后修飾在多肽中引入磷酸基團(tuán)[5]。近年來(lái)，有學(xué)者使用化學(xué)選擇性的Staudinger-亞磷酸酯反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了賴氨酸的位點(diǎn)特異性磷酸化（圖3） 4、豆蔻�；�和棕櫚酰化
用脂肪酸�；疦末端可以讓多肽或蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜結(jié)合。N末端上豆蔻�；�的序列可以使Src家族的蛋白激酶和逆轉(zhuǎn)錄酶Gaq蛋白靶向結(jié)合細(xì)胞膜。利用標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)反應(yīng)即可將豆蔻酸連接到樹(shù)脂-多肽的N末端，生成的脂肽可在標(biāo)準(zhǔn)條件下解離并通過(guò)RP-HPLC純化。
5、糖基化
糖肽類如萬(wàn)古霉素和替考拉寧是治療耐藥細(xì)菌感染的重要抗生素，其他糖肽常被用于刺激免疫系統(tǒng)。另外，由于很多微生物抗原是糖基化的，因此研究糖肽對(duì)提高感染的治療效果具有重要意義。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出異常的糖基化，這使得糖肽在癌癥和腫瘤免疫防御研究中也發(fā)揮著重要作用。糖肽的制備一般利用Fmoc/t-Bu方法。糖基化殘基，比如蘇氨酸和絲氨酸常通過(guò)五氟苯酚酯活化的Fmoc保護(hù)糖基化氨基酸引入到多肽中。
6、異戊二烯化
異戊二烯化發(fā)生在C末端附近側(cè)鏈上的半胱氨酸殘基。蛋白質(zhì)的異戊二烯化可以提高細(xì)胞膜親和性，形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。異戊二烯化的蛋白質(zhì)包括酪氨酸磷酸酶、小GTP酶、協(xié)同伴侶分子、核纖層和著絲粒結(jié)合蛋白。異戊二烯化的多肽可以利用樹(shù)脂上的異戊二烯化方法或者引入半胱氨酸衍生物制備[9]。
7、聚乙二醇（PEG）修飾
PEG修飾可用于改善蛋白水解穩(wěn)定性、生物分布和肽的溶解度[10]。在多肽上引入PEG鏈可以改善它們的藥理性質(zhì)，也可以抑制多肽被蛋白水解酶水解。PEG多肽比普通多肽更容易通過(guò)腎小球毛細(xì)血管截面，大大減少腎清除率。由于PEG多肽在體內(nèi)的有效半衰期延長(zhǎng)，因此使用更低劑量、更低頻度的多肽藥物便可以維持正常治療水平。但PEG修飾也存在負(fù)效應(yīng)。大量PEG在阻止酶降解多肽的同時(shí)也會(huì)減少多肽與目標(biāo)受體的結(jié)合。但PEG多肽的低親和力通常被其更長(zhǎng)的藥動(dòng)學(xué)半衰期抵消，通過(guò)在體內(nèi)存在更久，PEG多肽有更大可能性被目標(biāo)組織吸收。因此，PEG聚合物的規(guī)格應(yīng)該針對(duì)最佳結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化設(shè)計(jì)。另一方面，由于腎清除率降低，PEG多肽會(huì)在肝臟累積造成大分子綜合征。因此，當(dāng)多肽用于藥物測(cè)試時(shí)需要更加謹(jǐn)慎地設(shè)計(jì)PEG修飾。
PEG修飾劑常見(jiàn)的修飾基團(tuán)大致可總結(jié)如下：氨基（-Amine）-NH2，氨甲基-CH2-NH2，羥基-OH，羧基-COOH，巰基（-Thiol）-SH，馬來(lái)酰亞胺-MAL，琥珀酰亞胺碳酸酯-SC，琥珀酰亞胺乙酸酯-SCM，琥珀酰亞胺丙酸酯-SPA，N-羥基琥珀酰亞胺-NHS，丙酸基-CH2CH2COOH，醛基-CHO（如丙醛-ALD，丁醛-butyrALD），丙烯酸基（-Acrylate）-ACRL，疊氮基-Azide，生物素基-Biotin，熒光素基-Fluorescein，戊二酸基-GA，酰肼基-Hydrazide，炔基-Alkyne，對(duì)甲苯磺酸酯基-OTs，琥珀酰亞胺琥珀酸酯-SS等。帶有羧酸的PEG衍生物可以與N末端的胺或者賴氨酸側(cè)鏈進(jìn)行偶聯(lián)。氨基活化的PEG可以與門冬氨酸或者谷氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)。MAL活化的PEG可以與完全脫保護(hù)的半胱氨酸側(cè)鏈的硫醇進(jìn)行偶聯(lián)[11]。PEG修飾劑常見(jiàn)分類如下（注：mPEG即methoxy-PEG，CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH）： mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
（2）雙官能團(tuán)PEG修飾劑
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
（3）分枝形PEG修飾劑
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8、生物素化
生物素可以與親和素或者鏈霉親和素有力結(jié)合，結(jié)合強(qiáng)度甚至接近共價(jià)鍵。生物素標(biāo)記的肽通常用于免疫測(cè)定，組織細(xì)胞化學(xué)和基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)。標(biāo)記的抗生物素抗體也可以用來(lái)結(jié)合生物素化多肽。生物素標(biāo)記常連接在賴氨酸側(cè)鏈或者N末端。通常在多肽和生物素之間使用6-氨基己酸作為紐帶，紐帶能夠靈活結(jié)合底物，并且在有空間位阻的情況下能結(jié)合地更好。
9、熒光標(biāo)記
熒光標(biāo)記可用于追蹤活細(xì)胞內(nèi)多肽，也可用于研究酶和作用機(jī)制。色氨酸（Trp）帶有熒光，因此可以被用于內(nèi)在標(biāo)記。色氨酸的發(fā)射光譜取決于外圍環(huán)境，隨著溶劑極性降低而降低，這種性質(zhì)對(duì)于檢測(cè)多肽結(jié)構(gòu)和受體結(jié)合很有用處[12]。色氨酸熒光可以被質(zhì)子化的門冬氨酸和谷氨酸淬滅，這可能會(huì)限制其使用。丹磺酰氯基團(tuán)（Dansyl）與氨基結(jié)合時(shí)具有高度熒光，也常被用于氨基酸或蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記。
熒光共振能量轉(zhuǎn)換（FRET）對(duì)酶的研究十分有用，應(yīng)用FRET時(shí)，底物多肽常含有一個(gè)熒光標(biāo)記基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。標(biāo)記的熒光基團(tuán)會(huì)被淬滅劑通過(guò)非光子能量傳遞淬滅。當(dāng)多肽從所研究的酶上解離下來(lái)，標(biāo)記基團(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光。
10、籠形多肽
籠形多肽有光學(xué)移除性的保護(hù)基，光學(xué)移除性保護(hù)基可以屏蔽多肽與受體的結(jié)合。當(dāng)受到UV照射時(shí)，多肽會(huì)被活化，恢復(fù)與受體的親和力。由于這種光學(xué)活化可以根據(jù)時(shí)間、振幅或者位置來(lái)控制，因而籠形多肽可以被用于研究細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)[13]。最常用于籠形多肽的保護(hù)基是2-硝基芐基及其衍生物，它們可在多肽合成中通過(guò)保護(hù)的氨基酸衍生物而引入。已經(jīng)發(fā)展的氨基酸衍生物有賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸。而門冬氨酸和谷氨酸衍生物由于在多肽合成和解離過(guò)程中很容易環(huán)化，因此并不常用。
11、多聚抗原肽（MAP）
短肽通常不具有免疫性，必須和載體蛋白耦合才能產(chǎn)生抗體。多聚抗原肽（MAP）由多個(gè)連接到賴氨酸核的相同多肽構(gòu)成，能特異性表達(dá)高效免疫原，可用來(lái)制備肽-載體蛋白耦聯(lián)體。MAP多肽可以在MAP樹(shù)脂上利用固相合成法分步合成。然而，不完整的耦合會(huì)在一些分支上產(chǎn)生遺失或截?cái)嚯逆湥�因而表現(xiàn)不出原本MAP多肽的性質(zhì)。作為替代性的方法，多肽可以單獨(dú)制備和純化然后再耦聯(lián)到MAP上[14]。連接到多肽核心上的多肽序列是明確的，并且很容易通過(guò)質(zhì)譜表征。
結(jié)語(yǔ)：
多肽修飾是一種設(shè)計(jì)多肽的重要手段，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的多肽不僅可以維持較高的生物活性, 而且能夠有效地避免免疫原性和毒性方面的缺點(diǎn)，同時(shí)化學(xué)修飾可以賦予多肽一些新的優(yōu)良性能。近年來(lái)，利用C-H活化的手段對(duì)多肽進(jìn)行后期修飾的方法也得到了迅猛的發(fā)展，并取得了許多重要成果。后期，筆者也將對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)行綜述，敬請(qǐng)期待！