骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，簡(jiǎn)稱OA）是中老年人中常見(jiàn)的一種退行性關(guān)節(jié)疾病。根據(jù)美國(guó)疾控中心的統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)65歲以上的人群中，大約80%患有關(guān)節(jié)炎。軟骨退化影響了骨關(guān)節(jié)炎的治療。                    

近日，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院王巖教授和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京生物工程研究所葉棋濃教授等人領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎背后的分子機(jī)制進(jìn)行了深入剖析。他們發(fā)現(xiàn)，HPIP（全名為造血前B細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)錄因子相互作用蛋白）在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中起到重要作用。                  

這項(xiàng)成果于1月中旬發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。“我們發(fā)現(xiàn)，HPIP通過(guò)Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄激活以及轉(zhuǎn)錄程序的表觀遺傳調(diào)控來(lái)調(diào)控軟骨退化，表明HPIP有望帶來(lái)骨關(guān)節(jié)炎治療的新辦法，”作者在文中寫道。                  

之前的研究表明，HPIP蛋白主要在癌癥發(fā)生和發(fā)展中起到調(diào)節(jié)作用。例如，乳腺癌中HPIP-ER組成的復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)在體內(nèi)和內(nèi)外促進(jìn)了細(xì)胞增殖和遷移。此外，HPIP的沉默抑制了TGF-β誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。TGF-β是一種內(nèi)源性的細(xì)胞因子，在維持軟骨穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。然而，HPIP在骨關(guān)節(jié)炎中的作用仍然未知。
 

HPIP敲除可防止骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展

為了確定HPIP在骨關(guān)節(jié)炎中的作用，研究人員首先分析了118對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織及相應(yīng)非病變樣本中HPIP的表達(dá)水平。通過(guò)免疫組化染色和qRT-PCR分析，他們發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨中HPIP的表達(dá)明顯高于非病變組織。而且，HPIP的表達(dá)隨著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展而逐漸增加，而細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組分COL2A1和ACAN的表達(dá)逐漸減少，表明它可能參與關(guān)節(jié)軟骨退化中的ECM降解。

接下來(lái)，研究人員又分析了軟骨細(xì)胞特異性HPIP敲除小鼠的表型。他們委托賽業(yè)生物（Cyagen）制備了HPIPf/f小鼠，又購(gòu)買了Col2a1-CreERT2小鼠，從而制備出Col2a1-CreERT2/HPIPf/f小鼠。多個(gè)染色結(jié)果表明，與同窩的HPIPf/f小鼠相比，Col2a1-CreERT2/HPIPf/f小鼠表現(xiàn)出明顯的骨骼異常。它們的肱骨、股骨、脛骨和椎骨等骨骼的長(zhǎng)度比對(duì)照小鼠短10-21%。

那么，HPIP究竟在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中扮演了什么角色？他們對(duì)Col2a1-CreERT2/ HPIPf/f小鼠和HPIPf/f小鼠實(shí)施手術(shù)，將其膝關(guān)節(jié)中的前十字韌帶切除，并檢查手術(shù)后的軟骨厚度和覆蓋面積。在手術(shù)后4周和8周時(shí)，HPIPf/f小鼠的軟骨厚度和覆蓋面積都低于Col2a1-CreERT2/HPIPf/f小鼠。

此外，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展還伴有繼發(fā)性的臨床癥狀。轉(zhuǎn)棒儀和熱板分析和疼痛測(cè)定表明，HPIPf/f小鼠的熱板響應(yīng)時(shí)間增加，轉(zhuǎn)棒儀響應(yīng)時(shí)間、負(fù)重且行進(jìn)距離減少，而經(jīng)歷或未經(jīng)歷手術(shù)的Col2a1-CreERT2/HPIPf/f小鼠在轉(zhuǎn)棒儀或熱板響應(yīng)時(shí)間上沒(méi)有差異。因此，這些結(jié)果表明HPIP的敲除可以防止骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

為了進(jìn)一步研究HPIP在骨關(guān)節(jié)炎治療中的作用，研究人員對(duì)8周齡的C57BL/6J野生型小鼠進(jìn)行前十字韌帶切除術(shù)。兩周后，他們?cè)陉P(guān)節(jié)內(nèi)注射了AAV載體，此載體編碼HPIP特異性的shRNA。結(jié)果表明，未接受注射的小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的軟骨退化，并且軟骨厚度和覆蓋面積更低。這些結(jié)果表明HPIP特異性的shRNA可保護(hù)關(guān)節(jié)免受軟骨損傷。
 

HPIP調(diào)控了哪些信號(hào)通路？

研究人員接著對(duì)HPIP敲除的軟骨細(xì)胞和對(duì)照軟骨細(xì)胞開(kāi)展RNA-seq分析，以便確定HPIP調(diào)控的靶點(diǎn)。與對(duì)照細(xì)胞相比，HPIP敲除細(xì)胞存在1271個(gè)顯著差異表達(dá)基因（DEG），其中486個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，而包括COL2A1在內(nèi)的785個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本下調(diào)。此外，KEGG通路分析表明DNA復(fù)制、ECM-受體相互作用和Wnt信號(hào)通路下調(diào)，而p53信號(hào)通路上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明HPIP是維持軟骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。

之后，他們又利用全基因組染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）來(lái)確定HPIP的直接靶點(diǎn)。結(jié)果顯示HPIP存在3136個(gè)明顯的ChIP-seq峰，包括PBX1。他們接著分析了ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)的交集，發(fā)現(xiàn)有93個(gè)靶點(diǎn)受到HPIP缺失的直接調(diào)控。最終發(fā)現(xiàn)，在HPIP缺陷型的軟骨細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路下游靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。

酵母雙雜交和免疫共沉淀分析表明，HPIP與轉(zhuǎn)錄因子LEF1之間存在相互作用。HPIP過(guò)表達(dá)增加了Wnt多個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)，而內(nèi)源性LEF1的敲低抑制了Wnt靶點(diǎn)的表達(dá)并消除了HPIP調(diào)控Wnt靶點(diǎn)的能力，表明LEF1對(duì)于HPIP介導(dǎo)的Wnt靶點(diǎn)調(diào)控是十分重要的。

由于組蛋白乙�；�通常與基因的活躍轉(zhuǎn)錄有關(guān)，故研究人員深入探討了HPIP是否通過(guò)染色質(zhì)狀態(tài)的修飾來(lái)調(diào)控Wnt靶點(diǎn)表達(dá)。LEF1敲低降低了HPIP的招募以及多個(gè)基因的啟動(dòng)子上H3K56ac的乙�；�，表明H3K56ac活性對(duì)于HPIP調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄是重要的。這些數(shù)據(jù)表明，HPIP能夠直接激活Wnt信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)的表達(dá)，具體方式是對(duì)其啟動(dòng)子上的H3K56ac進(jìn)行乙�；�。

作者認(rèn)為，這些結(jié)果表明HPIP有望成為骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。不過(guò)，在未來(lái)開(kāi)展臨床試驗(yàn)之前，還需要進(jìn)一步研究來(lái)評(píng)估編碼HPIP特異性shRNA的慢病毒載體在大型骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型上的功效。

原文檢索

Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis
Nature Communications 10, Article number: 313 (2019)