利用SC-ICP-MS 法測(cè)定單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的鐵含量

瀏覽次數(shù)：6032　發(fā)布日期：2019-1-25　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

優(yōu)勢(shì)

ICP-MS 法可以分析成批培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中的總金屬含量，然后根據(jù)測(cè)得的細(xì)胞總數(shù)平均算出單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的鐵含量。由于平板計(jì)數(shù)法無法計(jì)算死亡細(xì)胞或未被培養(yǎng)的完整細(xì)胞，導(dǎo)致計(jì)數(shù)出現(xiàn)誤差。然而，由于儀器的限制，目前還未見有方法可直接分析單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的鐵含量�；趩渭�(xì)胞ICP-MS (SC-ICP-MS) 分析技術(shù)取得的重大進(jìn)展，使得直接測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)金屬含量成為現(xiàn)實(shí)。PerkinElmer 公司專利的Asperon™單細(xì)胞霧室將單個(gè)完整細(xì)胞引入ICP-MS的等離子體中，結(jié)合NexION® 系列ICP-MS 質(zhì)譜儀瞬時(shí)采集速度快的優(yōu)勢(shì)，可確定單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的鐵含量。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們利用SC-ICP-MS 法分別測(cè)定了三種菌株的單個(gè)細(xì)胞的鐵含量。這三個(gè)菌株分別是大腸桿菌B 株(Eco)、枯草芽孢桿菌168 株(BAC) 和紅球菌RHA1 株(RHA)。SC-ICP-MS 技術(shù)可直接測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的鐵含量，并確定每種菌株的鐵含量分布情況。鐵含量與細(xì)菌的細(xì)胞大小相關(guān)，即最大菌株(RHA)單個(gè)細(xì)胞的平均鐵含量最高，而最小菌株(Eco) 單個(gè)細(xì)胞的平均鐵含量最低。

內(nèi)容簡介

對(duì)于SC-ICP-MS 分析，大腸桿菌B 株、枯草芽孢桿菌168 株和紅球菌RHA1 株均生長至具有相同的光密度，并離心至一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞聚合體上。然后，立即將樣品冷凍、冷凍干燥并混勻。稱取制備好的樣品(10 - 30 mg) 放入Savillex® PFA 中。加入Optima® 級(jí)濃硝酸在電熱板上進(jìn)行密閉消解。消解后將樣品加熱至近干，復(fù)溶于5 mL 的0.05 M HNO3 中。加拿大國家研究院的NRCC 龍蝦肝胰臟(TORT-1) 作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)。使用純氨氣的反應(yīng)模式分析56Fe。

僅用于研究。不可用于診斷。

引言

鐵是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行各種生物過程所必須的金屬輔助因子。通常，鐵作為一種可抑制細(xì)菌生長的營養(yǎng)元素，細(xì)胞中的總鐵含量限額取決于細(xì)胞的生長狀態(tài)和代謝需要。細(xì)菌已進(jìn)化出復(fù)雜的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)細(xì)胞中鐵含量。 1 細(xì)胞內(nèi)多余的可溶性鐵是有毒的，這是由于過量的可溶性鐵產(chǎn)生會(huì)損傷細(xì)胞組分的活性氧，這意味著必須嚴(yán)格控制細(xì)胞中的鐵含量。然而，目前我們尚無法確定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)及整個(gè)細(xì)胞群內(nèi)鐵含量的調(diào)節(jié)情況。在確定細(xì)胞生長條件和應(yīng)激反應(yīng)的影響時(shí)，包括因使用抗生素產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，在近乎實(shí)時(shí)地測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞中的鐵含量可提供關(guān)于細(xì)菌中鐵耐受限值的信息。有趣的是，某些具有殺菌作用的粘土礦物和粘土提取物中的可溶性鐵含量很高，這可能會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。 2 此外，監(jiān)測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的鐵含量還可了解細(xì)胞中鐵的分布情況，從而確定細(xì)胞群的同質(zhì)性。

ICP-MS 法可以分析成批培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中的總金屬含量，然后根據(jù)測(cè)得的細(xì)胞總數(shù)平均算出單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的鐵含量。 3 由于平板計(jì)數(shù)法無法計(jì)算死亡細(xì)胞或未被培養(yǎng)的完整細(xì)胞，導(dǎo)致計(jì)數(shù)出現(xiàn)誤差。然而，由于儀器的限制，目前還未見有方法可直接分析單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的鐵含量。

基于單細(xì)胞 ICP-MS (SC-ICP-MS) 分析技術(shù)取得的重大進(jìn)展，使得直接測(cè)定單個(gè)細(xì)胞內(nèi)金屬含量成為現(xiàn)實(shí)。 PerkinElmer 公司專利的 Asperon™單細(xì)胞霧室將單個(gè)完整細(xì)胞引入 ICP-MS的等離子體中，結(jié)合 NexION® 系列 ICP-MS 質(zhì)譜儀瞬時(shí)采集速度快的優(yōu)勢(shì)，可確定單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的鐵含量。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們利用 SC-ICP-MS 法分別測(cè)定了三種菌株的單個(gè)細(xì)胞的鐵含量。這三個(gè)菌株分別是大腸桿菌 B 株 (Eco)、枯草芽孢桿菌 168 株 (BAC) 和紅球菌 RHA1 株 (RHA)。 SC-ICP-MS 技術(shù)可直接測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的鐵含量，并確定每種菌株的鐵含量分布情況。鐵含量與細(xì)菌的細(xì)胞大小相關(guān)，即最大菌株 (RHA)單個(gè)細(xì)胞的平均鐵含量最高，而最小菌株 (Eco) 單個(gè)細(xì)胞的平均鐵含量最低。

實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌培養(yǎng)物

本次實(shí)驗(yàn)分析了三種非致病性菌株，即大腸桿菌 B 株 (Eco)，枯草芽孢桿菌 168 株 (BAC) 和紅球菌 RHA1 株 (RHA)。根據(jù)以前的文獻(xiàn)報(bào)道，上述菌株的細(xì)胞尺寸分別約為 2 µm、 4 µm和 10 µm ± 2。 4-6 在本次實(shí)驗(yàn)中，平板分離的單克隆菌落分別接種于 3 個(gè) 5mL 的 LB 培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)，然后在振蕩培養(yǎng)箱中以 200 rpm 速度， 37℃過夜培養(yǎng)大腸桿菌 B 株和枯草芽孢桿菌 168 株；在振蕩培養(yǎng)箱中以 200 rpm 速度，于 30℃過夜培養(yǎng)紅球菌 RHA1 株。

從每種過夜培養(yǎng)物中取一份等分樣本 (1 mL)，接入到已經(jīng)預(yù)熱的含有 250 mL LB 培養(yǎng)基的燒瓶中，并將燒瓶放回振蕩培養(yǎng)箱中，使得菌落在上述條件下繼續(xù)生長。定期從每個(gè)燒瓶中取等分樣本 (1 mL)，使用 Cary 50 Bio 紫外可見分光光度計(jì)(Varian) 監(jiān)測(cè)光密度 (OD600)。大腸桿菌 B 株和枯草芽孢桿菌168 株持續(xù)生長，直至進(jìn)入后期對(duì)數(shù)生長期，最終 OD600 分別為 1.7 和 1.4。紅球菌 RHA1 株持續(xù)生長，直至進(jìn)入后期穩(wěn)定期，最終 OD600 為 2.3。

培養(yǎng)物被等分成 1 mL 樣本，并儲(chǔ)存在 50% 的甘油中于 -20℃保存，然后進(jìn)行 SC-ICP-MS 分析。菌落密度使用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行單位體積菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)。

SC-ICP-MS 分析

將細(xì)菌細(xì)胞樣品（表 1）放入 35℃水浴中解凍 1min，然后將樣品置于冰袋，使用 1% 磷酸鹽緩沖液 (PBS) 將樣品稀釋至含有 100,000 個(gè)細(xì)胞 /mL-1 的樣品稀釋液后立即上機(jī) SC-ICP-MS分析。樣品在使用前應(yīng)單獨(dú)解凍，以防止細(xì)菌隨著時(shí)間推移而降解。 SC-ICP-MS 以 dwell time50 µs（停留時(shí)間），每個(gè)樣品分析時(shí)間 1min，重復(fù)測(cè)定三次。測(cè)試將消耗 100 µL 樣品。通過采用 ICPMS 的純氨氣通入反應(yīng)池的模式（反應(yīng)模式），消除ArO+ 對(duì) 56Fe+ 的干擾。 SC-ICP-MS 工作條件見表 2。

本次實(shí)驗(yàn)利用濃度為 50,000 part/mL 的 NIST 60 nm (8013) 金納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，和濃度為 33,000 part/mL 的含有鑭系金屬（Ce、 Eu、 Ho 和 Lu）的 Fluidgim 2.5 µm 聚苯乙烯微球來測(cè)試方法傳輸効率 (TE)。使用濃度分別為 1、 2 和 3 ppb 的 Fe 離子標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行溶解離子校準(zhǔn)。所有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液的基質(zhì)均與樣品基質(zhì)匹配，均使用 1% PBS 制備。

ICP-MS 分析

對(duì)于 SC-ICP-MS 分析，大腸桿菌 B 株、枯草芽孢桿菌 168 株和紅球菌 RHA1 株均生長至具有相同的光密度，并離心至一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞聚合體上。然后，立即將樣品冷凍、冷凍干燥并混勻。稱取制備好的樣品 (10 - 30 mg) 放入 Savillex® PFA 中。加入Optima® 級(jí)濃硝酸在電熱板上進(jìn)行密閉消解。消解后將樣品加熱至近干，復(fù)溶于 5 mL 的 0.05 M HNO3 中。加拿大國家研究院的 NRCC 龍蝦肝胰臟 (TORT-1) 作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)。使用純氨氣的反應(yīng)模式分析 56Fe（ICP-MS 質(zhì)譜儀的工作條件見表 2）。

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