Lightigo LIBS元素分析技術在植物金屬元素分布快速Mapping中的應用
Lightigo是歐洲工程技術中心（CEITEC）的唯一衍生公司，公司成員均為布爾諾大學激光光譜與化學分析實驗室的科研人員。實驗室起始于1997年，在LIBS應用技術研發(fā)領域具有近20年的深厚經(jīng)驗，其研制生產(chǎn)的Sci-Trace LIBS元素分析系統(tǒng)獲得捷克國家2016年年度最佳合作獎冠軍。而在此之前，Lightigo團隊曾在歐洲LIBS元素分析大賽中斬獲第一名的優(yōu)異成績！
使用Sci-Trace，便意味著得到了全球頂尖的專業(yè)團隊技術支持和實驗室合作。
LIBS技術相較于其它元素分析方法，有其獨特和不可替代的優(yōu)勢
§ 較XRF技術無法檢測輕元素的遺憾而言，LIBS可以檢測所有元素;
§ 較ICP-MS等傳統(tǒng)方法，樣品無須預處理, 固、液、氣態(tài)樣品都可直接檢測，實時分析;
§ 測量速度可達1秒鐘20次，單次測量即可同時定性、半定量檢測元素周期表中所有元素;
不同的營養(yǎng)及礦物質含量，極大的影響植物的生長和代謝對于環(huán)境的響應。元素測量一直采用ICP-OES或者AAS的傳統(tǒng)方法，缺點是樣品預處理復雜，容易引入新的雜質并造成測量誤差。但最關鍵的是，無法得到元素分布的空間信息。而如若分布模式不同，即使含量相近，對植物生理狀態(tài)的影響也差異巨大。而LIBS技術可以在植物活體狀態(tài)下無須預處理進行元素mapping掃描快速分析，恰恰彌補了這一缺憾。LA-ICP-MS技術同也可進行元素分布掃描，但仍存很多問題有待克服：激光燒蝕樣品經(jīng)載氣運送至ICP，會在運送管中有顆粒物殘留； ICP中大顆粒氣化不完全；記憶效應（前次測量對下次測量結果的影響）；霧化室及運送管中的死角對信號強度和持續(xù)時間的影響；必須在同一位置多次測量才能獲得足夠強的信號等等。因此對于植物中元素分布的測量，LIBS被認為是最優(yōu)也是最有前景的測量技術。
Lightigo研究團隊很早就關注到LIBS技術在植物科學領域的應用。2006年，Jozef Kaiser博士（Lightigo CEO、布爾諾科技大學光譜技術實驗室主任）等即在European Physical Journal上發(fā)表了“Femtosecond laser spectrochemical analysis of plant samples”，應用libs技術對山茱萸整個葉片中的Fe、Mn元素進行分布mapping研究。當時在該實驗中，F(xiàn)e的LOD（檢測限）已經(jīng)做到5ppm。
Lightigo團隊應用LIBS技術在植物元素分析領域一直在孜孜不倦的探索，優(yōu)化算法、開發(fā)軟件、優(yōu)化儀器-----例如用真空反應室、雙激發(fā)技術等提高mapping分辨率，開發(fā)AtomAnalyzer光譜數(shù)據(jù)分析軟件將計算速度提高10倍，研制紫外真空模塊檢測0-300nm紫外光區(qū)域譜線等。測試對象既有活體植物，也有干枯樣品；包括植物根、莖、葉等植物各部分組織；植物種類包括旱生植物，也包括高水分含量的水生植物；定性定量測量的元素涉及對植物有重要影響的Al、Ca、C、Mg、P、Si、Sr、Zn、B、Cu、Fe、Mn、Pb、K、S、Na、Cl、H、N、Ni、Ba、Ag等等。并發(fā)表植物LIBS分析領域高影響因子文章如下：
- Pavlína M, Karel N, Pavel P, Jakub K, Přemysl L, Helena Z. G, Kaiser J, Comparative investigation of toxicity and bioaccumulation of Cd-based quantum dots and Cd salt in freshwater plant Lemna minor L. [J], Ecotoxicology and Environmental Safety, 147 (2018) 334–341.
- Krajcarová L, Novotný K, Kummerová M, J. Dubová J, Gloser V, Kaiser J. Mapping of the spatial distribution of silver nanoparticles in root tissues of Vicia faba by laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) [J], Talanta 173 (2017) 28–35.
- Lucie K, Novotny K, Petr B, Ivo P, Petra K, Vojtech A, Madhavi Z. Rene K, Kaiser J, Copper Transport and Accumulation in Spruce Stems Revealed by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy, [J]. Electrochemical Science, 8 (2013) 4485 – 4504.
- Zitka O, Krystofova O, Hynek D, et al. Metal Transporters in Plants [M]. Heavy Metal Stress in Plants. 2013: 19-41.
- Kaiser J, Novotny K, Martin M Z, et al. Trace elemental analysis by laser-induced breakdown spectroscopy—Biological applications [J]. Surface Science Reports, 2012, 67 (11–12): 233-243.
- Michaela G, Jozef K, Karel N, et al. Utilization of laser-assisted analytical methods for monitoring of lead and nutrition elements distribution in fresh and dried Capsicum annuum I. leaves [J]. Microscopy Research and Technique, 2011, 74 (9): 845-852.
- Diopan V, Shestivska V, Zitka O, et al. Determination of Plant Thiols by Liquid Chromatography Coupled with Coulometric and Amperometric Detection in Lettuce Treated by Lead (II) Ions [J]. Electroanalysis, 2010, 22 (11): 1248-1259.
- Kaiser J, Galiova M, Novotny K, et al. Utilization of the Laser Induced Plasma Spectroscopy for monitoring of the metal accumulation in plant tissues with high spatial resolution [J]. Networking IEEE/ACM Transactions on, 2010, 20 (4): 1096-1111.
- Kaiser J, Galiova M, Novotny K, et al. Mapping of lead, magnesium and copper accumulation in plant tissues by laser-induced breakdown spectroscopy and laser-ablation inductively coupled plasma mass spectrometry [J]. Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2009, 64 (1): 67-73.
- Krystofova O, Shestivska V, Galiova M, et al. Sunflower Plants as Bioindicators of Environmental Pollution with Lead (II) Ions [J]. Sensors, 2009, 9 (7): 5040-5058.
- Kaiser J, Galiova M, Novotny K, et al. Mapping of the heavy-metal pollutants in plant tissues by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy [C] Spectrochimica Acta Part B 64 (2009) 67–73.
- Galiova M, Kaiser J, Novotny K, et al. Investigation of heavy-metal accumulation in selected plant samples using laser induced breakdown spectroscopy and laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry [J]. Applied Physics A, 2008, 93 (4): 917-922.
- Sona K, Pavel R, Olga K, et al. Multi-instrumental analysis of tissues of sunflower plants treated with silver(I) ions – plants as bioindicators of environmental pollution [J]. Sensors, 2008, 8 (1): 445-463.
- Stejskal K, Mendelova Z, et al., Study of effects of lead ions on sugar beet [J]. Listy Cukrovarnicke A Reparske, 2008, 124 (4): 116-119.
- Galiova M, Kaiser J, Novotny K, et al. Utilization of laser induced breakdown spectroscopy for investigation of the metal accumulation in vegetal tissues [J]. Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2007, 62 (12): 1597-1605.
- Kaiser J, Samek O, Reale L, et al. Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by femto-second laser induced breakdown spectroscopy [J]. Microscopy Research and Technique, 2007, 70 (70): 147-153.
Lightigo團隊應用LIBS技術進行植物中金屬元素分布的研究案例
研究案例一浮萍（Lemna minor L.）是金屬元素環(huán)境污染的指示物種，也是常被用于金屬毒害和富集作用研究的模式生物。本案例中，AtomTrace團隊應用LIBS技術對浮萍做元素分布mapping，比較研究Cd鹽和QDs中的Cd元素在浮萍中的富集模式；并應用傳統(tǒng)ICP-OES技術對不同含Cd化合物在浮萍中的含量和富集進行測量；同時應用TEM方法探究QDs的富集位置---浮萍表面、細胞內部、還是植物組織內。
注：Cd離子在2015年275種重要有害物質清單中排名第7。含Cd量子點（QDs）通常由直徑3-6 nm 的CdS、CdSe、PbSe及CdTe和其它一些金屬元素構成，其外覆有有機聚合物。由于其染料效果優(yōu)于其它生物染料所以大量排放至水域中并在水中釋放出Cd離子，所以研究Cd量子點對生物的毒害作用有重要的應用意義。
使用雙激發(fā)LIBS技術研究Cd元素在浮萍小葉中的分布情況
實驗方法：
§ 浮萍葉片分別在含鎘化合物CdCl2、MPA-QDs 及 GSH-QDs 溶液（該三種溶液濃度皆分別設為三個梯度：0.1、 1和 10 mg/L）中處理。將小葉貼于載玻片上制作樣品；
§ LIBS測量采用正交雙激發(fā)。一次激發(fā)激光波長266nm，脈沖能量10mJ；二次激發(fā)激光波長1064nm，脈沖能量1064mJ；兩次激發(fā)激光脈沖長度均為5nm。每次測量均將葉片擊穿。
§ 掃描測量分辨率：200 μm；
§ Cd檢測主譜線：508.58 nm；
Fig. 4 Cd量子點及Cd鹽處理下浮萍小葉元素mapping圖像
實驗結論：§ CdCl2和Cd-QDs污染，對于Cd元素在浮萍葉片表面分布的影響無區(qū)別；
§ 濃度不同，對于Cd元素在浮萍葉片表面分布的影響無區(qū)別；
§ 實驗中三種含鎘化合物（CdCl2、MPA-QDs、GSH-QDs）濃度升高，LIBS檢測信號皆隨之增強；
§ 莖結處Cd元素富集作用明顯高于其它組織
引自：Pavlína, M., Karel, N., Pavel, P., J, K., P, L., H, Z.G., Jozef, K., 2018. Comparative investigation of toxicity and bioaccumulation of Cd-based quantum dots and Cd salt in freshwater plant Lemna minor L. [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety 147 (2018) 334–341
研究案例二
對植物組織的元素進行LIBS mapping分析，可以通過譜線位置判別元素種類，通過譜線強度得到元素濃度，而元素mapping圖像可以得到元素分布、以及若干種元素的相關位置分布信息。而在同一位置連續(xù)測量，即可得到元素剖面分布的3D信息。
Fig. 5 所示實驗研究：
Fig. 5 A：萵苣葉片上，Pb元素對Mg元素分布的影響。Mg是葉綠素的關鍵金屬，而Pb元素對葉綠素卻有更強的親和性，因此葉片中Pb濃度上升時，Mg濃度下降。
Fig. 5 B：Pb處理使玉米葉片中Pb濃度增加。
Fig. 5 C：植物對金屬離子毒害的抗性各不相同。如圖中所示向日葵葉片中，Pb處理對Mg元素的分布無影響。該實驗結果與形態(tài)學分析實驗結果一致。
Fig. 5 D：LIBS技術也可應用于植物其它組織中的元素分析。如圖中所示松樹枝條的雙激發(fā)LIBS測量所得的3D元素分布圖。
Fig. 5
引自：Jozef, K., Karel, N., et al., Trace elemental analysis by laser-induced breakdown spectroscopy—Biological applications. Surface Science Reports 67 (2012) 233–243研究案例三
根部對于植物養(yǎng)分供應、保護植物避免受到過量金屬離子的毒害方面發(fā)揮著重要作用，但是根部元素分析的難度要遠遠大于對莖部組織，原因包括：根通常要比莖和芽細小很多；干物質含量小很多，為樣品切割帶來很大不便；通常待分析元素相對含量較低；而柔軟多汁的樣品如何保持其結構形狀以得到元素分布的正確結果，同樣是個難題。
AtomTrace針對上述挑戰(zhàn)，在本案例中進行了成功的探索 --- 應用雙激發(fā)LIBS技術對蠶豆幼苗根部納米銀顆粒（直徑為21.7±2.3 nm）進行mapping分析，目標是對自然狀態(tài)下的植物組織進行元素檢測，獲得高mapping分辨率的同時確保檢測靈敏度。這同時也是整個LIBS領域中，對植物根部納米顆粒分布情況的初次嘗試。
LIBS雙激發(fā)技術 --- 即每次采集的測量信號，都為兩次激光脈沖激發(fā)。如此可減輕燒蝕擾動并提高mapping分辨率；同時兩次激發(fā)可增強信號，以獲得可重復性更高、更優(yōu)LOD（檢測限）的檢測結果。
實驗參數(shù)：二次激發(fā)脈沖能量分別為5MJ@266nm和100MJ@1064nm，間隔為500ns；測量頻率為1次/秒；實驗在1個大氣壓下進行。
實驗材料：蠶豆幼苗，分辨在AgNP溶液、Cu+和Ag+離子溶液處理7天，做40μm厚切片進行LIBS mapping測量。
實驗結果：由以下實驗結果可見，LIBS技術檢測速度快；即使對直徑只有2mm的幼根，也可對其橫切面中的金屬離子及金屬納米顆粒分布進行mapping分析，檢測的精確度和圖像分辨率足以滿足實驗需求。應用雙激發(fā)技術，Mapping分辨率可達到50μm，足以區(qū)分根表皮層、皮層、中柱中的元素分布特征。
此外，7天的短時間處理即可檢測結果，說明對自然環(huán)境中、自然養(yǎng)分條件下的植物來說，LIBS 元素mapping也是元素分布檢測行之有效的實驗方法，因此將是植物生理學和環(huán)境毒理學領域中的有效應用。
Fig. 6 蠶豆幼苗根橫切進行分辨率為50μm的單線測量后，燒蝕坑情況
Fig.7 Cu+溶液處理蠶豆幼苗根橫切不同分辨率下mapping結果：100μm、75μm、50μm
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