將200 µL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的白色念珠菌的菌懸液(106 CFU/mL)分別加入96孔板中，再加入20µL不同濃度的紫草素藥液，使其終濃度分別為64、32、16、8、4μg/mL，37℃培養(yǎng)24h后于595 nm處測(cè)定吸光值。以不加藥物組為空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。其中，紫草素對(duì)白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)值為菌體的OD值下降80%以上的最低藥物濃度。從大于MIC的各孔中分別取10µL菌懸液涂布于SDA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后觀察菌體生長(zhǎng)情況，最低殺菌濃度(MFC)為平板上沒(méi)有菌體生長(zhǎng)的最低藥物濃度。

 紫草素對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜滲透性的影響

     將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液按2%接種量接種于20mL RPM-1640液體培養(yǎng)基中，以150r/min、30℃恒溫培養(yǎng)16h后，離心棄上清液，用PBS洗滌菌體2次，制成適當(dāng)濃度的白色念珠菌菌懸液，分別向其中加入濃度為MIC和2MIC的紫草素繼續(xù)培養(yǎng)12h，每隔2h分別取樣液4mL，4000r/min離心10min棄沉淀，用紫外分光光度計(jì)于260nm下測(cè)定上清液中DNA和RNA等大分子物質(zhì)的變化。以不加藥為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

 紫草素對(duì)白色念珠菌形態(tài)的影響

     將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的白色念珠菌菌懸液(107 CFU/mL)接種于含紫草素終濃度為MIC的YEPD液體培養(yǎng)基中，150r/min、30℃振蕩培養(yǎng)。于6h和16h分別取1mL菌懸液，3000r/min離心5min后棄上清。再加入0.5mL PBS緩沖液和0.5mL 2.5%的戊二醛，4℃冰箱固定過(guò)夜。次日用PBS緩沖液沖洗2次，50%、80%、100%乙醇依次脫水1次，每次15min，100%乙醇浸沒(méi)的電鏡樣品置4℃冰箱中降溫10min后，放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的樣品溫度升至室溫后取出，噴金鍍膜，使用掃描電鏡觀察照相，以不加藥組為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

 紫草素對(duì)白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

     將2mL RPM-1640培養(yǎng)基及300μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液(106CFU/mL)分別加入6孔板中，每孔內(nèi)分別放一片無(wú)菌蓋玻片，37℃培養(yǎng)4h后，以加入300μL濃度為MIC的紫草素的孔為實(shí)驗(yàn)組，加入300μL去離子水的孔為空白對(duì)照組，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)16h。然后吸出每孔中的液體，用PBS緩沖液洗滌2次。陰干后于避光環(huán)境下向每孔中加入1mL 5μmol/L的鈣離子熒光探針(Fluo-3AM)，于37℃培養(yǎng)箱中孵育45min進(jìn)行探針裝載。吸出剩余的熒光探針染液并用PBS緩沖液沖洗，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育15min，以確保Fluo-3AM完全轉(zhuǎn)變?yōu)镕luo-3。取出蓋玻片，用10μL抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度，并按照公式(1)計(jì)算鈣離子濃度([Ca2+])變化百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

     制備10μL含紫草素終濃度為1/2MIC和MIC的菌懸液(106 CFU/mL)并用移液槍接種于卵黃培養(yǎng)基上，以加等量PBS的菌懸液為空白對(duì)照，于37℃下培養(yǎng)48h。待培養(yǎng)結(jié)束后，用刻度尺分別測(cè)量平板上的菌落直徑和沉淀圈直徑，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。磷脂酶的活性用PZ值表示，PZ值按下列公式計(jì)算。PZ值=菌落直徑/總直徑�？傊睆�=菌落直徑+菌落周?chē)�沉淀圈的直徑。PZ=1，表示無(wú)磷脂酶活性；PZ值<1，表示有磷脂酶活性，且PZ值越大，磷脂酶的活性越弱。

 紫草素對(duì)白色念珠菌PLB1和PLB2相對(duì)表達(dá)量的影響

      白色念珠菌PLB1和PLB2基因的檢測(cè): 提取模板DNA，根據(jù)GenBank中已發(fā)布的白色念珠菌的基因序列，利用Primer 5.0軟件及參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)磷脂酶相關(guān)基因PLB1和PLB2的上下游引物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增條件為94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。

      紫草素對(duì)白色念珠菌PLB1和PLB2相對(duì)表達(dá)量的影響: 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液接種到含紫草素終濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)16h后，采用Trizol法提取RNA，用微量核酸測(cè)量?jī)x進(jìn)行RNA濃度的定量。采用2步法反轉(zhuǎn)合成模板cDNA，根據(jù)設(shè)計(jì)合成RT-PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。以18SrRNA為內(nèi)參基因，以不加藥物組為空白對(duì)照。待反應(yīng)結(jié)束后分析RT-PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，并計(jì)算PLB1和PLB2基因的相對(duì)表達(dá)量。

 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

     采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。予以卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。