轉(zhuǎn)基因，豈能不知Tol2 ?

 

Tol2轉(zhuǎn)座子
 

       提及轉(zhuǎn)基因，大家首先映入腦海的是什么呢？轉(zhuǎn)基因大豆？玉米？食用油？（對(duì)于那些一個(gè)都想不到的孩紙們，小編我只想哭暈在廁所）名詞很熟悉，各大超市隨處可見，可何為轉(zhuǎn)基因，如何得到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品？今天小編簡(jiǎn)單來(lái)跟大家聊一聊。

       所謂轉(zhuǎn)基因，顧名思義，就是外源基因整合進(jìn)入宿主基因組，目前哺乳動(dòng)物系統(tǒng)最常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要包括Sleeping beauty(SB)，PiggyBac(PB)以及Tol2轉(zhuǎn)座子系列，然而，其中的“明星轉(zhuǎn)座子”當(dāng)屬Tol2！
 

1、Tol2轉(zhuǎn)座機(jī)制
 

  Tol2轉(zhuǎn)座子是Koga等人在日本青鳉魚中發(fā)現(xiàn)，屬于hAT轉(zhuǎn)座子家族，全長(zhǎng)4682bp，末端分別為17bp和19bp的反向重復(fù)序列，包含4個(gè)外顯子（圖1），編碼蛋白含有649個(gè)氨基酸殘基。

   Tol2作為一個(gè)自主的轉(zhuǎn)座元件，自身可以編碼轉(zhuǎn)座酶，且迄今為止，是在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的唯一具有自主轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子^[1]。將轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)序列部分缺失， 但保留轉(zhuǎn)座酶識(shí)別和結(jié)合區(qū)域序列，Tol2便無(wú)法發(fā)生自主轉(zhuǎn)座（圖1）。

圖1 Tol2轉(zhuǎn)座子序列^[1]

       利用這一特性，可以以外源基因替代轉(zhuǎn)座酶編碼序列，構(gòu)建Tol2轉(zhuǎn)座載體，與轉(zhuǎn)座酶cDNA載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，外源基因便會(huì)以“剪切-粘貼”的方式整合入基因組中且不會(huì)引起任何靶位點(diǎn)的重排和修飾^[2], 如圖2.

圖2 Tol2轉(zhuǎn)座機(jī)制^[2]

2、Tol2應(yīng)用
 

   Tol2轉(zhuǎn)座子具有不定向性，即在基因組中是隨機(jī)插入，并無(wú)序列特異性，那既然Tol2都如此任性了，留之何用呢？

   起初，科學(xué)家們利用這一特性，將其作為基因捕獲和增強(qiáng)子捕獲的工具以進(jìn)行突變體篩選，從而確定機(jī)體發(fā)育過(guò)程中重要功能基因的突變體。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，自動(dòng)化的基因高通量篩選鑒定早已不在話下，以為tol2會(huì)就此淘汰？不存在的！如今的tol2轉(zhuǎn)座子依舊在建立穩(wěn)定基因表達(dá)細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因大、小鼠的制備等方面發(fā)揮著其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

   當(dāng)然，實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)，2009年，Zoltán Ivics等^[3]就為大家詳細(xì)闡述了Tol2轉(zhuǎn)座機(jī)制在鼠中的應(yīng)用，具體流程如圖3，通過(guò)不斷地表型篩選，Tol2系統(tǒng)可以用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鼠和穩(wěn)定的基因表達(dá)細(xì)胞系。 

圖3 利用Tol2構(gòu)建轉(zhuǎn)基因鼠和基因表達(dá)細(xì)胞系^[3]
 

3、Tol2轉(zhuǎn)座優(yōu)勢(shì)
 

與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法相比，Tol2轉(zhuǎn)座子法優(yōu)勢(shì)明顯，主要表現(xiàn)在以下幾方面：

相對(duì)更高的轉(zhuǎn)基因效率

不同品系小鼠中，同一轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率存在差異，相同品系小鼠中，Tol2較SB、PB在生殖細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座效率更高^[4]‍，如表1。

表1 不同轉(zhuǎn)座子在生殖細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座效率

無(wú)位點(diǎn)特異性

相較于PB、SB，Tol2轉(zhuǎn)座子靶點(diǎn)的選擇性更高，沒有明顯的位點(diǎn)特異性（8-bp的雜合堿基序列），在染色體上比較傾向整合于基因的5＇端區(qū)域^[3]，如表2。

表2  SB,PB和Tol2的基因組位點(diǎn)特異性比較

 

無(wú)堿基傾向性

Tol2轉(zhuǎn)座子，插入位點(diǎn)的堿基序列可以不同，沒有明顯的堿基傾向性^[5]。如表3。

表3 Tol2插入位點(diǎn)的堿基傾向性

 

無(wú)過(guò)度抑制效應(yīng)

如下表4所示，隨著轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子的比例增大，PB轉(zhuǎn)座效率逐漸飽和甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶會(huì)抑制PB的轉(zhuǎn)座反應(yīng)，即過(guò)度抑制效應(yīng)，但Tol2較之轉(zhuǎn)座效率不受影響， 沒有出現(xiàn)抑制效應(yīng)^[6]。

表4  PB，Tol2轉(zhuǎn)座抑制效應(yīng)比較

 

   除此外，tol2轉(zhuǎn)座無(wú)需絕緣子，可攜帶大片段外源DNA，目前百奧賽圖已利用該系統(tǒng)成功將13kb外源DNA片段轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)！

  好啦，篇幅有限，今日科普到此結(jié)束，不過(guò)我很快還會(huì)再回來(lái)的！需要tol2轉(zhuǎn)基因小鼠的各位老板們，百奧賽圖等著你哈~~

【參考文獻(xiàn)】

[1] Koga A. and Hori H. The Tol2 transposable element of the medaka fish: an active DNA-based element naturally occurring in a vertebrate genome[J]. Genes & Genetic Systems, 2001, 76:1-8.

[2] DNA transposon-based gene vehicles - scenes from an evolutionary drive. J Biomed Sci. 2013 Dec 9;20:92.

[3] Transposon-mediated Genome Manipulations in Vertebrates. Nat Methods. 2009 June ; 6(6): 415–422. 

[4] Efficient transposition of Tol2 in the mouse germline. Genetics. 2009 Dec;183(4):1565-73. 

[5] A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 2010 May;95(5):306-11. 

[6]. Efficient genetic modification and germ-line transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jun 5;109(23):E1466-72.

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